[发明专利]一种1型鸭甲肝病毒抗体竞争ELISA检测方法

说明书

本发明提供一种1型鸭甲肝病毒抗体竞争ELISA检测方法，解决了目前种鸭和雏鸭体内的DHAV‑1抗体效价及商品化DHAV‑1卵黄抗体效价难以评估的问题；包括单克隆抗体的制备，检测方法包括以下步骤：抗原包被、洗涤、封闭、洗涤、酶标抗体、洗涤和TMB显色，测定反应各孔OD450nm值；计算血清样品的抑制率，抑制率(％)＝(酶标抗体OD值‑样本OD值)×100％/酶标抗体OD值；若PI≥15.21％时，血清为阳性；PI<15.21％时，则判定为阴性。本发明的单抗竞争ELISA检测方法具有单克隆抗体的高度特异性和ELISA试验的高敏感性，结果稳定性好，可以商品化和自动化，可以用肉眼判定。

技术领域

本发明涉及动物医学技术领域，特别涉及一种1型鸭甲肝病毒抗体竞争ELISA检测方法。

背景技术

鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitisvirus，DHV)引起雏鸭的一种急性、高度致死性传染病，主要侵害1～3周龄的雏鸭，是严重危害养鸭业的主要传染病之一。目前，该病的已发生于全世界各个养鸭的国家和地区。

鸭病毒性肝炎由3种不同类型的病毒引起的，分别是1型鸭肝炎病毒(DHV-1)、2型鸭肝炎病毒(DHV-2)和3型鸭肝炎病毒(DHV-3)，其中2型和3型鸭肝炎病毒是独立的病原体。近年来，随着鸭病毒性肝炎的发生及新毒株的出现，关于鸭病毒性肝炎的分类有了新的标准。2007年，台湾学者Tseng等和韩国学者Kim等分别在台湾和韩国分离鉴定出与DHV-1没有抗原相关性的DHV新型，并将其命名为台湾新型和韩国新型鸭肝炎病毒。根据最新出版的国际病毒分类委员会(ICTV)第九次分类报告，将DHV-1、台湾型鸭肝炎病毒、韩国型鸭肝炎病毒分别定名为鸭甲肝炎病毒(Duck hepatitis A virus 1,DHAV-1)、DHAV-2和DHAV-3。

目前，我国流行的鸭病毒性肝炎主要是DHAV-1。而实际生产中防制该病的最常见、最有效的方法之一便是对种鸭进行免疫，利用后代体内的母源抗体来保护雏鸭渡过最易感的危险期。因此，在生产实践中就迫切需要一种敏感性好且简单有效的方法来检测免疫后种鸭体内的抗体水平。

目前，DHAV-1抗体的检测方法主要有病毒中和试验、琼脂扩散试验、免疫荧光技术、间接ELISA方法等。

①中和试验的测定结果准确、可靠，但费时、费力，胚体需采用SPF级别，试验的成本较高，在生产实践中难以推广应用。

②琼脂扩散试验操作简便、方便，适用于多个血清样品的定性检测，但由于试验中所采用的抗原是全病毒DHAV-1，DHAV-1的纯化难度较大，杂蛋白较难除掉，而且试验对检测抗体的要求也较高，抗体的纯度及稀释倍数都要达到一定的水平才能出现结果，灵敏度不高，故限制了其在实践生产中应用。

③免疫荧光技术对试验设备及实验人员的操作技能都有很高的专业要求，费用高，因此该方法一般只局限于实验室阶段，难以在生产实践中大范围推广应用。

④间接ELISA方法是一种敏感性和特异性好的检测方法，能够对多个血清样品进行检测。已有的与本发明最相近的实现方案是间接ELISA方法。目前建立的间接ELISA方法有两种类型，一种是采用1型鸭肝炎全病毒作为包被抗原，但由于鸭肝炎病毒的纯化难度较大，且纯化过程中会受到一些杂蛋白的影响，故该检测方法虽然已经建立，但目前应用的较少；一种是利用鸭肝炎病毒VP1基因的原核表达蛋白作为包被抗原，上海兽医研究所已经建立了该检测方法，并且已经申请了专利，但该方法目前也是处于实验室检测阶段，还没有广泛应用于临床实践。

间接ELISA的具体实施方法如下：

①包被抗原的制备：若包被抗原为全病毒，一般采用9-12日龄的鸭胚扩增DHAV-1病毒，尿囊腔接种，0.2ml/只鸭胚，37度孵化，弃掉24小时死亡的胚体，收集24-96小时内死亡的鸭胚的尿囊液。利用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒，最终获得包被抗原。