[发明专利]疏水作用层析提纯口蹄疫灭活病毒抗原的方法

说明书

本发明涉及一种从细胞培养液中提纯口蹄疫灭活病毒抗原的方法。该方法通过口蹄疫病毒表面的疏水基团和疏水作用层析填料上的疏水基团之间的相互作用，将口蹄疫灭活病毒抗原吸附在层析柱上，从而与溶液中的杂质分开。采用温和的洗脱条件就可以把吸附在层析柱上的口蹄疫灭活病毒抗原洗脱下来，达到提纯的目的。该方法速度快，操作步骤少，工艺稳定，口蹄疫灭活病毒抗原收率高，且易于放大与工业化规模生产，具有较大的实际应用价值。

技术领域

本发明涉及疫苗抗原分离纯化领域，具体地，涉及一种从细胞培养液中分离纯化口蹄疫灭活病毒疫苗抗原的层析分离方法。

背景技术

口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus,FMDV)引起的烈性传染病，主要感染对象为牛、羊、猪等偶蹄类动物，非偶蹄类动物也会被感染，但症状相对较轻。口蹄疫疫情往往会给畜牧业带来了巨大的损失。由于口蹄疫传染性强、传播速度快、危害性大，自20世纪初开始，口蹄疫一直是国际卫生界关注的焦点，各国纷纷建立研究机构以找到控制口蹄疫的方法。一直到19世纪末，口蹄疫病毒才真正被人类被发现。

最早关于口蹄疫病毒疫苗是法国Vallée、Carré等人于1926年发明的，他们已经测试了甲醛对于不同口蹄疫病毒灭活的作用，并最终通过在20℃用0.5％的甲醛灭活病毒4-7天，将灭活的病毒作为疫苗，达到了较好的保护水平。截止到今天，常用的口蹄疫疫苗依然是基于化学方法灭活的口蹄疫病毒，首先通过摇瓶或悬浮法大规模的培养幼仓鼠肾细胞(BHK-21细胞)，之后将活的口蹄疫病毒接种到细胞中，再将病毒收获后浓缩、化学试剂灭活，与缓冲液和佐剂混合后制成口蹄疫疫苗。

随着科学技术的发展，人们对疫苗的质量要求也越来越高。目前口蹄疫苗存在主要两个问题：1.免疫保护力不稳定，免疫后检测不到抗体或产生抗体的水平低，或者免疫期较短；2.安全性差，副反应强，表现为动物在注射疫苗后出现减食，停食甚至死亡等情况。其主要原因是现有的口蹄疫疫苗制备工艺多为传统方法，纯化工艺简单，细胞培养液及宿主细胞中的多种杂质及过敏性物质并未除去，且抗原含量较低。这一现状对我国口蹄疫疫情的控制及兽用疫苗产业的发展带来极大影响。

口蹄疫灭活病毒抗原主要是146S，其纯化方法主要包括聚乙二醇沉淀，超滤除杂，双水相萃取等。这些方法难以获得高纯度的口蹄疫疫苗抗原。蔗糖密度梯度离心法能获得高纯度的口蹄疫灭活病毒，但这种方法不仅成本高，且难以应用于工业化生产。

层析技术是一种易于工业放大，且能进行精度纯化的技术。目前层析技术已经用于多种人用疫苗及蛋白质药物的分离纯化，但在兽用疫苗领域应用尚较少。最近有专利报道采用凝胶过滤的方法来纯化口蹄疫病毒抗原(内蒙古必威安泰生物科技有限公司.口蹄疫纯化疫苗及其制备方法和应用.中国发明专利:CN 102988970 B,2014-06-18.)。凝胶过滤处理量小，料液的进料量仅为凝胶过滤柱体积的1/10，而且经过凝胶过滤后抗原的浓度会进一步下降，这些都是本领域研究人员都知晓的有关凝胶过滤存在的问题。这些问题导致加工时间长，材料成本高，而且抗原在长时间的加工中也容易失去免疫活性。

本发明涉及一种适合于大规模从细胞培养液中提纯口蹄疫灭活病毒抗原的方法。该方法通过口蹄疫病毒表面的疏水基团和疏水作用层析填料上的疏水基团之间的相互作用，将口蹄疫灭活病毒抗原吸附在层析柱上，从而与溶液中的杂质分开。采用温和的洗脱条件就可以把吸附在层析柱上的口蹄疫灭活病毒抗原洗脱下来，达到提纯的目的。该方法速度快，操作步骤少，工艺稳定，口蹄疫灭活病毒抗原收率高，且易于放大于工业化规模生产，具有较大的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从细胞培养液中分离纯化口蹄疫病毒抗原146S，同时具有高抗原收率的纯化方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：