[发明专利]一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法

权利要求书

1.一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，其特征在于具体包括以下步骤：

（1）、配制0.01-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH7.0-9.5；

（2）、激发波长为320nm-380nm，发射波长为440nm-480nm；

（3）、用pH7.0-9.5、浓度为0.01-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液配制浓度为5×10^-4-0.39×10^-5 mol/L的辅酶Ⅰ溶液，并测定辅酶Ⅰ溶液荧光值，然后以辅酶Ⅰ溶液荧光值为横坐标、以辅酶Ⅰ浓度为纵坐标，获得辅酶Ⅰ溶液荧光值和辅酶Ⅰ浓度之间的标准曲线；

（4）、取细胞培养液经4℃、5000r/min离心15min，收集所得的细胞中加入为细胞体积3倍的磷酸缓冲液，然后在超声功率150W，超声6s间隔8s，超声总时间28min进行细胞破碎，然后控制温度0-6℃、转速8000-14000r/min离心10-30min，收集上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；

所述的磷酸缓冲液按每升计算，含0.24g KH₂PO₄，1.44g Na₂HPO₄, 8.0g NaCl，0.2g KCl和余量的水；

或取血液作为粗乙醛脱氢酶酶液；

或组织匀浆液控制温度0-6℃、转速8000-14000r/min离心10-30min，收集的上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；

（5）、将步骤（4）所得的粗乙醛脱氢酶酶液、pH7.0-9.0，0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液、1×10^-3-5×10^-3mol/L乙醛水溶液、0.1-0.5 mol/LKCl水溶液、5×10^-4-1×10^-3 mol/L NAD⁺水溶液和0.01-0.05mol/L硫基乙醇水溶液混合，形成的反应体系控制温度为25-40℃保持10-30min后，在激发波长为320nm-380nm，发射波长为440nm-480nm下，测定反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；

所述的反应体系，按每3ml计算，其组成及含量如下：

pH7.0-9.0，0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液 2.57.ml

1×10^-3-5×10^-3mol/L乙醛水溶液0.1ml

0.1-0.5 mol/LKCl水溶液 0.1ml

5×10^-4-1×10^-3 mol/L NAD⁺水溶液 0.1ml

0.01-0.05mol/L硫基乙醇水溶液 0.03ml

粗乙醛脱氢酶酶液 0.1ml；

（6）、步骤（3）所得辅酶Ⅰ溶液荧光值x和 辅酶Ⅰ浓度y之间标准曲线的线性方程为：

y=0.0686x-3.6621，y的单位为1×10^-4mol/L

定义每生成0.0686×10^-4mol/L辅酶Ⅰ为一个酶活力单位U；

根据下述的公式计算乙醛脱氢酶酶活力；

酶活力单位（U/mL）=△荧光值/3；

其中△荧光值为步骤（5）中的反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；3mL是反应体系总体积。