[发明专利]一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，属酶工程中酶活检测技术领域。

背景技术

人体由肠道吸收摄入的乙醇，主要在肝脏内代谢。乙醇进入体内后，首先在乙醇脱氢酶(ADH)的作用下使乙醇脱氢转化为乙醛，然后在由乙醛脱氢酶(ALDH)的催化作用下，使乙醛氧化生成乙酸，乙酸通过三羧酸循环(TCA)分解为CO2和水，并释放能量生成ATP。

乙醛是毒性很强的物质，在体内是潜在的致癌物质，能够干扰DNA的合成和修复，对人体组织和器官有高度的致毒，致突变，致癌的作用，乙醛脱氢酶的代谢活性直接影响体内乙醛的代谢，对人体的健康状态产生重大影响。

研究乙醛脱氢酶酶活力的检测方法具有重要意义。现有方法主要包括：紫外分光光度计法、HPLC、GC。其中，紫外分光光度计法最为常见，主要原理是在340nm处检测NADH紫外吸收值变化来反映酶活性，此检测方法灵敏度低，吸光度的变化与实际酶活的对应关系不够理想。而HPLC、GC检测方法的原理是通过检测乙醛或乙酸含量来测定酶活，但检测方法较复杂，实验时间长无法实时监测酶活，同时酶液成分复杂造成杂峰较多，对实验有干扰。

发明内容

本发明的目的之一是为了解决在使用紫外分光光度法检测乙醛脱氢酶酶活时，检测灵敏度较低，而在使用HPLC法时，步骤较复杂、时间较长，且无法实时监测酶活力等技术问题而提供一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，该检测方法具有检测速度快、灵敏度高等优点。

本发明的技术原理

本发明采用荧光分光光度计检测乙醛脱氢酶酶活力，主要依据在于NADH的荧光性质，NADH以320-380nm为激发波长，发射波长为440-480nm左右，荧光物质含量与荧光峰值成正比。采用荧光分光光度计建立NADH的荧光标准曲线，用于计算待测酶液催化反应生成的NADH含量计算酶活性，提高了测定酶活的灵敏度，为检测乙醛脱氢酶酶活提供了一种新的实用方法。

本发明的技术方案

一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，具体包括以下步骤：

(1)、配制0.01-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH7.0-9.5；

(2)、激发波长为320nm-380nm，发射波长为440nm-480nm；

(3)、用pH7.0-9.5、浓度为0.01-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液配制浓度为5×10^-4-0.39×10^-5mol/L的辅酶I溶液，并测定其辅酶Ⅰ溶液光值，然后以辅酶Ⅰ溶液荧光值为横坐标、以辅酶Ⅰ浓度为纵坐标，获得辅酶Ⅰ溶液荧光值和辅酶Ⅰ浓度之间的标准曲线；

(4)、取细胞培养液经4℃、5000r/min离心15min，收集所得的细胞中加入为细胞体积3倍的磷酸缓冲液，然后在超声功率150W，超声6s间隔8s，超声总时间28min进行细胞破碎，然后控制温度0-6℃、转速8000-14000r/min离心10-30min，收集上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；

所述的磷酸缓冲液按每升计算，含0.24g KH₂PO₄，1.44g Na₂HPO₄,8.0g NaCl，0.2g KCl和余量的水；

或取血液作为粗乙醛脱氢酶酶液；

或组织匀浆液控制温度0-6℃、转速8000-14000r/min离心10-30min，收集的上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；

(5)、将步骤(4)所得的粗乙醛脱氢酶酶液、pH7.0-9.0，0.1mol/L Tris-HCl缓冲液、1×10^-3-5×10^-3mol/L乙醛水溶液、0.1-0.5mol/LKCl水溶液、5×10^-4-1×10^-3mol/L NAD⁺水溶液和0.01-0.05mol/L硫基乙醇水溶液混合，形成的反应体系控制温度为25-40℃保持10-30min后，在激发波长为320nm-380nm，发射波长为440nm-480nm下，测定反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；

所述的反应体系，按每3ml计算，其组成及含量如下：

(6)、步骤(3)所得辅酶Ⅰ溶液荧光值x和辅酶Ⅰ浓度y之间标准曲线的线性方程为：