[发明专利]一种利用无色透明EVA热熔胶棒制作真菌分生孢子器临时玻片标本的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域。具体涉及子囊菌门真菌分生孢子器的显微制片。

背景技术

显微技术已成为在细胞学、组织学、胚胎学、植物解剖学、微生物学、古生物学及孢粉学发展中的一个重要研究手段。在光学显微镜下观察生物体内部的微细结构之前，由于生活时的生物器官组织过大或过厚不能在显微镜下观察，或者能放在显微镜下，光线也不能透过，而且一些微细结构的折光率相同，即使光线能透过也看不清楚。所以，必须根据材料的特性，采用不同的方法，对材料进行处理，把材料制成透明的玻片标本。根据材料的性质和制作方法的不同，常用的显微制片技术可以分为切片法和非切片法两大类。

切片法常用的有石蜡切片法、火棉胶切片法、徒手切片法、冰(冷)冻切片法等，其中以石蜡切片法最为常用。

对于子囊菌门(Ascomycota)的真菌而言，观察其分生孢子器内子囊及子囊孢子的数量、大小、排列方式等形态特征，是鉴定其分类地位的主要方法。真菌界子囊菌门的分生孢子器大小约为100μm～200μm，小而易碎，采用徒手切片法难以制片，通常采用石蜡切片法进行制片，其操作流程如下：

(1)取材：从PDA培养基平板上取分生孢子器，分别放入烧杯中备用；

(2)固定：将FAA固定液倒入有材料的烧杯中，固定24h；

(3)冲洗：用70％乙醇换洗3次，每次0.5h～2h；

(4)脱水：用80％、90％乙醇脱水各10min，无水乙醇(中间换一次)10min；

(5)透明：无水乙醇及二甲苯(1:1，体积比)混合液中10min，二甲苯(中间换一次)7min～8min；

(6)透(浸)蜡：预备有石蜡与二甲苯(1:1，体积比)制成的石蜡盒3个，将透明后的材料分别放入石蜡盒Ⅰ、石蜡盒Ⅱ各1h,放入石蜡盒Ⅲ12h～24h。透蜡在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55℃～60℃左右；

(7)包埋：将完全渗透好的石蜡材料置于装有纯石蜡的纸盒中，待完全凝固后取出备用；

(8)切片：使用切片机将已固定好的石蜡块进行切片，切片厚度一般为4μm～

10μm，蜡带长度10mm～20mm；

(9)贴片：将切好的蜡带放入45℃蒸馏水中使其舒展后，贴于涂抹有蛋白甘油的载玻片上，置于47℃的烘片机上烘干固定；

(10)染色：根据实际需要，可用HE染色法，即苏木精(Hematoxylin)和伊红(曙红，Eosin)染色法进行染色。经95％及无水乙醇梯度脱水，二甲苯透明后，迅速擦去材料周围多余液体后封片；也可不经染色直接封片；

(11)封片：滴加适量(1滴～2滴)中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡，封片后即制成永久性玻片标本，在光镜下可长期反复观察。

应用传统的石蜡切片法制作真菌细胞器玻片标本具有切片薄、制片效果好、能制作连续切片、封片后能长期保存、可反复观察的优点；但其耗时长(耗时约2d～3d)、步骤复杂、且需要切片机(国产价格约6万元/台、进口价格约30万元/台)等复杂、贵重的专用设备。

市售的无色透明EVA热熔胶棒的规格通用的是直径在11.2mm±0.3mm和11.2mm±0.7mm，长度在200mm到300mm,多应用于塑料、金属、木材、纸类、皮革、陶瓷等粘合。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有徒手切片法无法处理小而软的真菌分生孢子器、传统石蜡切片法用时长、且工序复杂、效率较低、所需专用设备昂贵、制片成本高的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是一种利用无色透明EVA热熔胶棒制作真菌分生孢子器临时玻片标本的方法，包括步骤以下：

(1)取材

在5倍的体视显微镜下，从PDA培养基平板上挑取真菌分生孢子器，放到载玻片上备用；

(2)固定和脱水

在所述真菌分生孢子器上滴加25μL～200μL无水乙醇脱水，待真菌分生孢子器表面发硬；

(3)包埋

将无色透明EVA热熔胶棒的一端置于酒精灯上加热其熔而不滴，室温冷却1s～2s后，用针将步骤(2)所述真菌分生孢子器挑入经过酒精灯上加热至熔而不滴的无色透明EVA热熔胶棒的该端内包埋，将包埋了所述真菌分生孢子器的无色透明EVA热熔胶棒的该端置于水中冷却至该端固化；

(4)切片

在5倍的体视显微镜下，用刀片对包埋好的真菌分生孢子器进行切片，切片厚度为100μm～150μm，切成3-5片，切片长度为4mm～6mm；

(5)染色和/或脱水处理