[发明专利]基于流式细胞术测定浅水湖泊中异养细菌大小的方法

权利要求书

1.一种基于流式细胞术测定浅水湖泊中异养细菌大小的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）样品固定：在待测样品中加入终体积浓度为0.5-1.5%，优选1%的固定剂，避光2-4小时；

（2）样品前处理：吸取至少500μl样品，用无菌水1:8-1:12，优选1:10稀释后进行超声波处理；

（3）样品染色：吸取1ml样品，在样品中加入特异性核酸染料SYBR Green Ⅰ，避光静置；

（4）样品的流式细胞分析：将样品管放置于流式细胞仪的样品台上，通过流式细胞仪对样品进行测试，采集前向散射光FSC、侧向散射光SSC、FL1通道的核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号、FL3通道的自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号数据；其中以核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号设置域值，利用绿色荧光信号将浅水湖泊中的浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来，同时根据FL3通道采集的自养浮游生物的叶绿素a的红色荧光信号，将细菌与浮游藻类区分开来，最后通过流式细胞仪测试异养细菌的FSC值代表细菌大小；

（5）细菌大小标准曲线的绘制：选取不同粒径规格标准绿色微球，利用流式细胞仪分别进行测试，采集前向散射光FSC、侧向散射光SSC、FL1通道的绿色荧光信号，通过多次测定它们的FSC值，建立细胞粒径与FSC 的关系；

（6）数据分析：通过流式细胞仪分析软件分析采集到的数据，利用前向散射光与侧向散射光的不同，排除微型浮游生物对细菌检测的影响；依据核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号的强弱，将浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来；根据自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号的强弱，将细菌与浮游藻类区分开来，从而获得目标对象样品中的异养细菌，通过流式细胞仪得到异养细菌前向散射光FSC值，再根据细菌大小的标准曲线计算出样品中异养细菌的大小。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定剂为甲醛，多聚甲醛或戊二醛中的一种，优选甲醛。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的超声波处理条件Es=P*t/V=1400-1600 KJ/L，其中P为超声功率，t为超声时间，V为样品体积。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述超声功率P为10-100W，超声时间t为2-30min，样品体积V为1-100ml。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，超声波处理条件Es=P*t/V=1500KJ/L，其中超声功率P为25W，超声时间t为5min，样品体积V为5ml。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中向样品中加入特异性核酸染料SYBR GreenⅠ对其进行染色；黑暗静置15-30min。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的特异性核酸染料SYBR GreenⅠ先用TE进行1:100稀释作为母液，漩涡振荡30s，再取母液进行1:100稀释，至特异性核酸染料SYBR GreenⅠ终浓度为10^-4，向1ml样品中加入10uL母液使特异性核酸染料SYBR GreenⅠ终浓度为10^-4，黑暗静置20min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）利用流式细胞仪对样品进行分析时，根据纯培养细菌在流式细胞图中的分布位置，调节各个检测器的电压值，调整仪器的设置，将样品置于流式细胞仪样品管中，流速控制在每秒1000个细胞以内，共收集20000个细胞。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）包括：吸取0.5μm，0.8μm，1μm，3μm，6μm多种粒径规格标准微球各1μl，用无菌水1:100稀释后涡旋振荡，充分混匀后分别通过流式细胞仪进行测试，调节各个检测器的电压，直至在散点图（FSC,SSC）和散点图（FL1,SSC）上清晰可见，流速控制在每秒1000个细胞以内，共收集20000个细胞。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述的流式细胞仪分析软件采用Becton Dickinson公司开发的CellQuest软件，记录下多种标准粒径微球前向散射光（FSC）信号数据, 建立标准微球粒径与FSC值的关系，绘制细菌大小的标准曲线，建立回归分析方程，计算相关系数，再通过样品中异养细菌的前向散射光FSC值，换算成异养细菌的大小。