[发明专利]基于流式细胞术测定浅水湖泊中异养细菌大小的方法

说明书

技术领域

本发明属于环境微生物学领域，涉及一种在浅水湖泊中针对异养细菌大小的检测方法，通过与流式细胞技术相结合，建立一种应用于大型浅水湖泊异养细菌大小的快速检测方法。

背景技术

细菌是湖泊生态系统中食物网和食物链的重要组成部分，在湖泊生态系统的生物地球化学循环和能量流动过程中发挥着重要作用。它们不仅分解有机化合物释放能量，而且能利用藻类所无法吸收的DOM，将之转化为POM，进行二次生产，提高湖泊生态系统总的生态效率。所以，估算细菌的生物量对于研究湖泊生态系统是十分重要的。细菌的菌体大小是指细菌的体积，计算细菌生物量大部分通过转换系数把细菌体积转换成生物量。因此，细菌大小是细菌生物量估算的过渡性参数，是湖泊微生物研究的一个关键参数。

细菌菌体大小的测定方法目前最常用的是荧光显微镜和电子显微镜法。荧光显微镜技术是利用荧光探针将细菌细胞与其他颗粒区分开来，从而达到检测目的。但是光学显微镜的分辨率有限，难以准确测定很小的细菌。电子显微镜有较高的分辨率和放大倍数，小的细菌也能被确定的测定。但是它的处理步骤繁琐，而且细菌细胞在处理过程中易发生皱缩和扭曲，细菌大小很可能在测定过程中产生误差。

流式细胞术测定细菌大小是一种新兴的方法，它是与荧光探针相结合区分细菌与其他颗粒细胞。这种方法对细菌细胞个体大小的分析是以收集到小角度的前向散射光(FSC)与细菌的大小和形状等之间的相关性为基础的。通过流式细胞仪测定法对单个细胞的散射光信号进行检测可应用于不规则细菌种群，特别是小细菌大小的测定。目前通过流式细胞术测定异养细菌大小大部分应用于海洋生态系统，尚未有将流式细胞技术应用于湖泊，特别是浅水富营养化湖泊上的相关报道。而由于湖泊水体中存在大量的颗粒和固相物质，包括很多非生物颗粒，细胞碎屑等，它们会对流式细胞仪造成很大的干扰，背景噪音也随之提高，流式细胞仪分析的难度也加大，已有技术无法有效用于富营养化湖泊异养细菌的快速检索，有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明旨在克服针对目前荧光显微镜和电子显微镜检测细菌大小存在的众多缺陷，提供一种通过与流式细胞技术相结合快速准确检测浅水湖泊异养细菌大小的方法，该方法测定速度快，灵敏度高，仪器精确度高，测定过程干扰小，重复性好，数据的准确性高(统计学上)，可开展大规模的生态学调查。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于流式细胞术测定浅水湖泊中异养细菌大小的方法，包括以下步骤：

(1)样品固定：在待测样品中加入终体积浓度为0.5-1.5％，优选1％的固定剂，避光2-4小时；

(2)样品前处理：吸取至少500ul样品，用无菌水1:8-1:12，优选1:10稀释后进行超声波处理；

(3)样品染色：吸取1ml样品，在样品中加入特异性核酸染料SYBR Green Ⅰ，避光静置，以使DNA着色；

(4)样品的流式细胞分析：将样品管放置于流式细胞仪的样品台上，通过流式细胞仪对样品进行测试，采集前向散射光FSC、侧向散射光SSC、FL1通道的核酸染料SYBR Green Ⅰ绿色荧光信号、FL3通道的自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号数据；其中以核酸染料SYBR Green Ⅰ绿色荧光信号设置域值，利用绿色荧光信号将浅水湖泊中的浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来，同时根据FL3通道采集的自养浮游生物的叶绿素a的红色荧光信号，将细菌与浮游藻类区分开来，最后通过流式细胞仪测试异养细菌的FSC值代表细菌大小；

(5)细菌大小标准曲线的绘制：选取多种粒径规格标准绿色微球，利用流式细胞仪分别进行测试，采集前向散射光(FSC,反映细胞大小)、侧向散射光(SSC，反映细胞内部结构)、FL1通道的绿色荧光信号。通过多次测定它们的FSC值，建立细胞粒径与FSC的关系，制作细菌大小的标准曲线，建立回归分析方程，计算相关系数。再通过样品中异养细菌的前向散射光(FSC)值，换算成异养细菌的大小。

(6)数据分析：通过流式细胞仪分析软件分析采集到的数据，利用前向散射光与侧向散射光的不同，排除微型浮游生物对细菌检测的影响；依据核酸染料SYBR Green Ⅰ绿色荧光信号的强弱，将浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来；根据自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号的强弱，将细菌与浮游藻类区分开来，从而获得目标对象样品中的异养细菌，通过流式细胞仪得到异养细菌前向散射光FSC值，再根据细菌大小的标准曲线计算出样品中异养细菌的大小。

其中，所述的固定剂为甲醛，多聚甲醛或戊二醛中的一种，优选甲醛。