[发明专利]提高胰岛素及其类似物制备效率的方法

权利要求书

1.对重组表达的甘精胰岛素前体进行纯化的方法，其中所述方法包括如下步骤：对原核表达的甘精胰岛素前体包涵体采用羟基磷灰石介质进行层析，层析条件为：层析pH 8.0，依次用含有1M NaCl、10mM NaH₂PO₄、50mM NaH₂PO₄和500mM NaH₂PO₄的层析液进行盐浓度洗脱；

对获得的甘精胰岛素前体包涵体进行复性；以及

对复性的甘精胰岛素前体采用羟基磷灰石介质进行层析，层析条件为：层析pH 8.0，依次用含有500mM NaCl、5mM NaH₂PO₄、20mM NaH₂PO₄和200mM NaH₂PO₄的层析液进行盐浓度洗脱。

2.权利要求1的方法，其中所述方法还包括如下步骤：

在大肠杆菌表达体系中原核表达甘精胰岛素前体，获得甘精胰岛素前体包涵体。

3.权利要求1-2任一项的方法，其中所述甘精胰岛素前体的氨基酸序列为前肽链—B链—连接肽链—A链，各链之间共价连接，其中前肽链为MKR，B链为FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRR，连接肽链为EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR，和A链为GIVEQCCTSICSLYQLENYCG。

4.制备有活性的甘精胰岛素的方法，其中包括如下步骤：

在大肠杆菌表达体系中原核表达甘精胰岛素前体，获得甘精胰岛素前体包涵体；

对所述甘精胰岛素前体包涵体采用羟基磷灰石介质进行层析，层析条件为：层析pH8.0，依次用含有1M NaCl、10mM NaH₂PO₄、50mM NaH₂PO₄和500mM NaH₂PO₄的层析液进行盐浓度洗脱；

对所获得的甘精胰岛素前体包涵体进行复性；

对复性的甘精胰岛素前体采用羟基磷灰石介质进行层析，获得纯化的甘精胰岛素前体，层析条件为：层析pH 8.0，依次用含有500mM NaCl、5mM NaH₂PO₄、20mM NaH₂PO₄和200mMNaH₂PO₄的层析液进行盐浓度洗脱；

采用Kex-2p酶对所述甘精胰岛素前体进行酶切，其中所述Kex-2p酶的酶切条件为：Kex-2p酶与甘精胰岛素前体摩尔浓度比为1：3000，4℃反应48小时；和

对酶切产物进行一步层析纯化，以获得有活性的甘精胰岛素。

5.权利要求4的方法，其中所述一步层析纯化采用C8反相柱。

6.权利要求5的方法，其中所述C8反相柱层析的条件为：Buffer A含有0.2M Na₂SO₄,50mM H₃PO₄,pH 2.5-4，Buffer B含有50％ACN、0.2M Na₂SO₄,50mM H₃PO₄,pH 2.5-4.0，线性梯度洗脱。