[发明专利]提高胰岛素及其类似物制备效率的方法

说明书

本发明提供了对重组表达的甘精胰岛素前体进行纯化的方法，其中包括采用羟基磷灰石介质对所述甘精胰岛素前体进行层析的步骤。本发明还提供了制备有活性的甘精胰岛素的方法，其中包括采用Kex‑2p酶对重组表达的甘精胰岛素前体进行酶切的步骤。在本发明一个优选实施方案中，所述方法包括：获得重组表达的甘精胰岛素前体；采用Kex‑2p酶对所述甘精胰岛素前体进行酶切；对酶切产物进行一步层析纯化，以获得有活性的甘精胰岛素。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，更具体地说，涉及长效胰岛素类似物甘精胰岛素的制备方法。

背景技术

糖尿病是威胁人类健康的重大疾病，全球发病率逐年上升。胰岛素是治疗糖尿病的关键药物，可有效控制血糖，已经被临床广泛应用和接受。为了满足不同的使用需求，人们研发出了多种胰岛素类似物，在起效时间上为患者提供了多种选择。

胰岛素及其类似物包含A、B两条肽链，通过二硫键相互连接。在重组表达过程中，胰岛素及其类似物通常以融合蛋白形式存在，即A、B两条肽链之间由连接肽(即C链)连接，纯化并得到构象正确的融合蛋白后，再用特定工具酶对融合蛋白进行水解，去除连接肽。胰岛素及其类似物可用酵母菌或大肠杆菌表达，分别具有优势和局限。酵母菌表达的胰岛素及其类似物以可溶形式分泌到发酵液中，可以直接纯化和酶切，但发酵周期长、成本高。大肠杆菌表达的胰岛素及其类似物以包涵体蛋白形式存在，需要经过复性才能够获得天然构象的前体蛋白，然后再进行酶切，但具有发酵周期短、产量高和成本低的优点。可见酶切是一个重要的工艺步骤，对于原核和真核表达体系的产物普遍适用。

甘精胰岛素(insulin glargine)是一种长效胰岛素类似物，具有血药浓度平稳、没有峰值和作用时间长的特点，很受患者欢迎。目前，全世界生产甘精胰岛素的企业只有法国的赛诺菲安万特公司和中国的甘李药业。甘精胰岛素的构建是通过在人胰岛素B链C端添加两个精氨酸，同时将A链C端的N21突变成Gly获得的。甘精胰岛素由于具有这样特殊的氨基酸序列，其制备方法，特别是酶切和酶切后纯化工艺，与野生型重组人胰岛素存在很大差别。特别是由于甘精胰岛素中的两个精氨酸紧邻，常规的胰酶和羧肽酶两步酶切法效率较低，错切率较高，而且副产物较多，为后续纯化工艺带来很大负担，显著提高了甘精胰岛素的制备难度和成本。例如，赛诺菲公司的专利申请CN101253196B中提供了一种使用重组猪胰蛋白酶及其变体切割甘精胰岛素前体的方法，酶切效率分别是58.1％和62.9％；中国专利申请CN 201210532873.8中提供了一种甘精胰岛素前体的酶切转化方法，包括采用牛胰蛋白酶水解甘精胰岛素前体的步骤，其中通过调整酶切反应条件，牛胰蛋白酶的酶切效率可达到86％。

Kex-2p酶是一个特异性水解两个连续碱性氨基酸后羧基端肽键的蛋白酶，酶切位点是后一个碱性氨基酸的羧基端。Kex-2p酶的使用可显著提高甘精胰岛素融合蛋白的酶切效率，显著降低错切率，为后续纯化工艺带来便利。Nagaraj Govindappa等发明了将Kex-2p酶和甘精胰岛素融合蛋白在酵母工程菌中共表达的技术(专利申请号PCT/IB2012/052853，此处通过援引将其全部内容并入本文)，但共表达工程菌中目的蛋白的表达率受到了很大影响，难以满足大规模生产的需求。此外，该酶是一个糖蛋白，分子量大，经原核表达时复性困难。因此，这种共表达的方法在具有多种优势的原核表达体系中难以实现，使该技术的应用进一步受到限制。