[发明专利]一种抗肝纤维化基因药物rAAV8-KAL

说明书

技术领域:

本发明涉及分子药物学，具体地说涉及重组腺相关病毒载体携带Kallistatin基因在抗肝纤维化中的的应用。

背景技术:

肝纤维化是各类慢性肝病进一步发展、恶化的重要环节，若能在肝纤维化阶段消除致病因素并给予适当治疗，对于我国这一肝病大国意义十分重大。肝脏在纤维化过程中，普遍存在缺氧、炎症、氧化应激、门脉高压和血管增生等症状，因此，有效的抗纤维化药物应将针对多靶点、多途径作为其主要研究方向。目前此类药物大多为重组蛋白，需反复给药，麻烦不便。临床医学研究表明，持续稳定剂量给药比间断性峰值给药更为有效、副作用更低，而新兴的基因药物治疗技术恰能实现持续稳定的给药途径。

Kallistatin是一种内源性血管生成抑制因子，具有抗炎症、抗氧化、舒张血管、抗血管生成、抗肿瘤等多种生物学功能，对肝纤维化进程涉及到的各种症状起到一对一的抑制作用；重组腺相关病毒载体(rAAV)以其高稳定性，低致病性、低免疫原性、宿主范围广、分裂或非分裂细胞都能感染，以及持久表达目的基因等多方面优势，被认为是最有希望的临床基因药物治疗载体，尤其是在纤维化的肝脏中，粒径仅为20nm的rAAV能更加有效穿越肝窦内皮层进而转导肝细胞或肝星状细胞，是一种比较理想的肝纤维化基因药物治疗载体，在AAV的众多血清型中，8型AAV载体是目前对肝靶向性最好的一种rAAV载体，可以将Kallistatin以持续稳定剂量运输到肝脏中。

本实验室将rAAV8-kallistatin基因药物，经尾静脉注射到四氯化碳CCl4诱导的肝纤维化模型小鼠体内，并观察32天，发现rAAV8-Kal不仅对肝纤维化有显著疗效，且能在整个观察期内维持稳定水平表达。本实验涉及的rAAV8-kallistatin基因药物能够有效治疗肝纤维化的研究成果，迄今尚未见有国内外的相关报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种用于治疗肝纤维化的基因药物，以解决现有治疗肝纤维化药物靶点单一、需长期反复给药等问题。

本发明的基因治疗药物，由8型rAAV介导Kallistatin基因的表达，其具体特征是：病毒载体为8型rAAV；抗纤维化治疗基因为Kallistatin；基因表达框依次含有CMV/CAG鸡β-actin启动子、Kallistatin基因、WPRE(Woodchuck hepatitis Post-transcriptional Regulatory Element)增强子、polyA尾巴，基因表达框两端为AAV2ITR(inverted terminal repeat sequence)。

不同血清型的AAV序列虽具有较高同源性，但每个AAV型都具有不同的衣壳，而衣壳则是决定AAV趋性和转导特点的主要因素。本发明以rAAV2质粒为基因表达质粒，分别采用rAAV2、8辅助质粒进行包装，得到两种血清型的rAAV病毒。通过动物实验发现，rAAV2/8在肝纤维化治疗中效果更佳。

本发明所述基因药物采用三质粒转染法制备，即采用磷酸钙法将表达质粒与辅助质粒共同转染293细胞，并于60-72小时后收获重组病毒，经层析纯化后备用。

本发明提供了rAAV8-KAL在制备抗肝纤维化药物中的应用。

本发明还提供了以rAAV8-KAL为有效成分与药学上可接受的一种或多种载体组成的药物组合物。

本发明还提供了所述组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。

本发明的基因药物优先选用静脉注射的给药方式。

本发明的有益效果在于：提供了一种针对多靶点通过多途径的肝纤维化基因治疗药物，所述基因药物不仅能够有效治疗肝纤维化，且无需重复给药，能在体内长时间维持稳定表达水平。

附图说明：

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。

图1-各组小鼠肝脏外观

其中：a为正常组；b为造模刚完成；c为模型组；d为rAAV2-Kal治疗组；e为rAAV8-Kal治疗组。

图2-各组小鼠肝脏HE染色(×100)

图3-各组小鼠肝脏苦味酸天狼猩红染色(×100)

图4-各组小鼠肝功能指标(ALT、AST、TBIL)检测结果

其中：N为正常组；M为模型组；2K为rAAV2-Kal治疗组；8K为rAAV8-Kal治疗组(VSM组:*p<0.05,**p<0.01)。

图5-各组小鼠血清中HA、LN、C-Ⅲ、C-Ⅳ水平检测结果