[发明专利]一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒。

背景技术

猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)是一种环状、无囊膜的单股DNA病毒，它包括猪1型圆环病毒(PCV-1)和猪2型圆环病毒(PCV-2)两个基因型。猪群普遍存在PCV-1，但PCV-1不具有致病性，而PCV-2的感染能够导致断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic wasting syndrome,PMWS)、怀孕母猪繁殖障碍、猪皮炎肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、猪呼吸道病综合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)和仔猪的A2型先天性震颤(Congenital tremors,CT)等多种疾病。

断奶仔猪多系统呼吸衰竭综合征(PMWS)主要影响6-8周龄的猪群，多发于保育后期和转肥育舍的前期阶段，主要症状为生长发育不良，皮肤与可视性黏膜苍白或黄疸、贫血，呼吸困难、皮肤苍白、消瘦、腹泻、体表淋巴结，特别是腹股沟淋巴结肿大，偶有咳嗽和中枢神经系统紊乱等症状，死亡率约为8％～35％。此外，PMWS常与繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌等病原发生混合感染，而使PMWS的症状更加复杂化；猪皮炎肾病综合征(PDNS)是一种免疫介导的血管疾病，其主要病变在皮肤和肾脏。该病通常发生于8～18周龄的猪群发病率为0.15％～2％，有时达到7％。临床症状主要为会阴部、四肢、胸腹部及耳朵等处皮肤发生圆形或不规则的隆起，呈红色或紫色，中央为黑色的斑块，这些斑块有时会相互融合成条带状，在极少情况下皮肤病变会消失。病猪表现厌食、消瘦、苍白、跛行、结膜炎、腹泻，皮下水肿，有时体温上升。患病猪剖检可见肾脏苍白，肿大，表面有瘀斑，病理组织学变化为出血性坏死性皮炎、动脉炎及渗出性肾小球性肾炎和间质性肾炎；母猪繁殖障碍(Reproductive failure)，PCV-2感染猪群会出现繁殖障碍的症状，导致妊娠母猪发生流产、死胎、木乃伊胎及断奶前仔猪死亡率高；猪呼吸道综合症(PRDC)主要影响11～22周龄的育肥猪和育成猪，主要临床症状为生长缓慢、精神沉郁、饲料效率低下、厌食、发热、咳嗽、腹泻及呼吸困难等症状。但一般PCV-2单纯感染不会出现PRDS的临床症状，而是与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流感、猪肺炎支原体、传染性胸膜肺炎放线杆菌等其他病原混合感染是才导致PRDC；猪增生性和坏死性肺炎(PNP)主要影响6～14周龄的猪只，死亡率达4％～10％，表现为增生性和坏死性肺炎。PNP能形成特征性的肺脏损伤，其确诊主要根据组织病理学变化(如坏死性和溃疡性细支气管炎、纤维闭塞性细支气管炎，肺泡壁形成肉芽肿性炎症等)。

目前，国内采用的PCV-2检测技术主要有：病毒分离培养、间接免疫荧光、免疫酶单层试验、原位杂交、酶联免疫试验等，这些方法均存在操作复杂、实验条件要求高、特异性不强、耗时长、不适合大规模检测等不足。因此，研制开发用于普通实验的快速、简便的PCV2检测方法，实现PCV2的快速诊断，对疫病的预防和控制有着重要意义。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种猪2型圆环病毒(PCV-2)等温PCR现场快速检测试剂盒，本发明利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的6个区域，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在定性检测时不需任何特殊设备，只需眼观反应管道颜色变化即可判定，因此具有特异性、敏感性高和检测时间比普通PCR短、适用于猪场现场的快速检测等特点。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种2型猪圆环病毒等温PCR现场快速检测试剂盒，包括引物组合物、10倍等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂，所述的引物组合物由外引物和内引物组成，所述的外引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述的内引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

本发明所述的外引物与内引物的摩尔数之比为1:6～9；

所述的10倍等温扩增反应液由200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、40～100mmol/L硫酸镁、4～10mol/L甜菜碱、5～18mmol/L的dNTPs和质量百分浓度0.1％的Triton X-100组成。