[发明专利]人体血清免疫球蛋白中的病毒灭活方法

说明书

技术领域

本发明涉及药物生产过程中的病毒灭活方法，具体是静脉注射用的人体血清免疫球蛋白生产过程中的病毒灭活方法。

背景技术

人免疫球蛋白（IgG）是从人血浆中纯化得到，其由B细胞和浆细胞接触抗原后产生，其分子量大约为150KDa，由四条肽链组成，两条完全相同的轻链（L）和重链（H）通过两个二硫键共价相连，除此之外，以非共价交联形成一个均匀对称的Y型二聚物。轻链由两个同源结构域组成，重链由四个同源结构域组成，这些结构域的特征是包含2个β-折叠结构，包括3到5个反相平行β-链，通过一个二硫键来维持结构稳定。这些结构域对热敏感，在加热条件下其二级结构可发生改变，当温度超过50℃时，可使这些β折叠转变为无规卷曲，这将导致形成多聚体。这可以通过对人免疫球蛋白溶液的分子大小分布进行检测确认。

IgG制剂主要用于原发性和继发性免疫球蛋白缺乏症，以及其他的自身免疫性疾病，如原发性血小板减少性紫癜、川崎病等。

尽管已经采取了诸如献血人员的病毒筛查，但人们仍然认为血浆蛋白制品具有感染经血传播病毒的危险。世界卫生组织（WHO）不断关注血浆制品的安全性，出台了一系列有关支持和建议要求。人血浆制品生产过程中应有特定的去除或者灭活病毒方法，目前关于病毒灭活的方法提出了巴氏灭活、有机溶剂/去污剂（S/D）病毒灭活法、干热病毒灭活法、低pH病毒灭活法、膜过滤等，人免疫球蛋白制品采用以上病毒灭活方法，均存在缺陷，或者难以保持免疫球蛋白天然结构，或者无法完全灭活脂包膜和非脂包膜病毒，例如：S/D和低pH方法无法灭活非脂包膜病毒，干热病毒灭活法仅适用于冻干制品，而且可破坏人免疫球蛋白的天然结构，巴氏病毒灭活使人免疫球蛋白天然结构发生了改变，产生聚合物，膜过滤由于蛋白质溶液分子量大，过滤困难，难以实现规模化操作，而且该步骤必须和其它灭活方法联合运用。

CN1448407A公开一种静脉注射用人免疫球蛋白的生产工艺，包括以下步骤，以FⅡ+Ⅲ的沉淀物为原料进行溶解、在溶液中加乙醇调pH值到5.15离心分离，取其上清液，在上清液中加乙醇调pH值到7.25并降温到-6.5℃作离心分离，取沉淀物、将上步沉淀物溶解后加入甘氨酸保护剂后在60℃下保持10小时进行病毒灭活，对灭活后溶液进行-8℃的低温分离后取沉淀物进行溶解并调pH值到4.1±0.3，用0.2um孔径的膜进行过滤除菌，然后分装和密封，将分装的制品置于24℃的环境中放置21天，作低pH病毒灭活处理。该工艺十分复杂，免疫球蛋白变性和形成多聚体严重。

CN103550780A公开一种巴氏灭活静注人免疫球蛋白的蛋白质保护剂及其灭活方法，将灭活前的静注人免疫球蛋白溶液加入蛋白质保护剂，然后调整样品蛋白质含量40g/L～60g/L，pH值4.7～5.3，搅拌30分钟后，放入60℃±1℃水浴中，待溶液温度到60℃计时，保持溶液温度60℃±0.5℃10小时，即完成静注人免疫球蛋白的灭活，所述的蛋白质保护剂为蔗糖、精氨酸、甘氨酸、山梨醇，其最终含量分别为：50g/L～70g/L、20g/L～40g/L、30g/L～60g/L及240g/L～260g/L；免疫球蛋白多聚体的含量可降到了1.96%。但多聚体含量仍然较高，并且将免疫球蛋白长期储存后，免疫球蛋白多聚体会迅速提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人体血清免疫球蛋白在生产过程中高温灭活病毒的方法，该方法可使病毒灭活过程免疫球蛋白的损耗大大降低。

本发明将免疫球蛋白沉淀物或溶液在2—4℃条件下，用缓冲溶液稀释至浓度为0.01—0.25mmol/L，调整pH值至3—4.5，添加巯基保护剂、糖稳定剂和氨基酸稳定剂，升温至55—65℃保温6—12小时，再降温至0—2℃保温0.5—3小时以上，然后升温至10—20℃，保温72小时以上。

所述巯基保护剂为L-半胱氨酸或其盐酸盐、谷胱甘肽的一种或以上，其摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的20—100倍；所述糖稳定剂为麦芽糖或海藻糖的一种或以上，其摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的60—1000倍；所述氨基酸稳定剂为脯氨酸或其盐、甘氨酸或其盐、丝氨酸或其盐的一种或以上，其摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的100—1200倍。

优选的是，巯基保护剂的摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的40—70倍，糖稳定剂的摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的150—700倍，氨基酸稳定剂的摩尔浓度为免疫球蛋白摩尔浓度的400—1000倍。