[发明专利]用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1的方法

权利要求书

1.用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1的引物，其核苷酸序列为：

SAIA-F/SAIA-R：CCTCCCATCCTTGATTCTCTT/TTGGGATCGTTCATCCAGTTC；

SAIP-F/SAIP-R：GTGGAGCAATGCGATGCTGC/CAGCATCAGATGTCCGTGACC。

2.用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1前半段序列的引物，其核苷酸序列为：

SAIA-F/SAIA-R：CCTCCCATCCTTGATTCTCTT/TTGGGATCGTTCATCCAGTTC。

3.用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1后半段序列的引物，其核苷酸序列为：

SAIP-F/SAIP-R：GTGGAGCAATGCGATGCTGC/CAGCATCAGATGTCCGTGACC。

4.用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1的方法，包括如下步骤：

(1)以待测高粱品种为材料，提取样品基因组DNA；

(2)采用权利要求2所述的引物SAIA-F/SAIA-R，以样品基因组DNA为模板进行PCR反应A，获得扩增产物；若扩增产物中出现大小为635bp片段，则回收、克隆、测序该635bp片段，即SAI-1基因的前段；

(3)采用权利要求3所述的引物SAIP-F/SAIP-R，以样品基因组DNA为模板进行PCR反应B，获得扩增产物；若扩增产物中出现大小为3232～3412bp之间的单一片段，则回收、克隆、测序所述单一片段，为SAI-1基因的后段；

(4)将获得的所述SAI-1基因的前段和所述SAI-1基因的后段进行序列拼接，获得待测高粱品种的可溶性酸性转化酶基因全长。

5.根据权利要求4所述的方法，所述PCR反应A的体系为：反应的总体积50μl，其中2×PCR Buffer for KOD FX 25μl，2mmol/L dNTPs 10μl，ddH₂O 10μl，10μmol/L引物SAIA-F/SAIA-R各1.5μl，KOD FX 1μl，样品基因组DNA 1μl。

6.根据权利要求4或5所述的方法，所述PCR反应A的程序为：94℃预变性2min；98℃10s，61℃30s，68℃30s，30个循环；68℃延伸10min。

7.根据权利要求4所述的方法，所述PCR反应B的体系为：反应的总体积50μl，其中2×PCR Buffer for KOD FX 25μl，2mmol/L dNTPs 10μl，ddH₂O 10μl，10μmol/L引物SAIP-F/SAIP-R各1.5μl，KOD FX 1μl，样品基因组DNA 1μl。

8.根据权利要求6或7所述的方法，所述PCR反应B的程序为：94℃预变性2min；98℃10s，60℃30s，68℃3m30s，30个循环；68℃延伸10min。