[发明专利]用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1的方法，属于分子生物学和遗传学领域。

背景技术

高粱是一种抗逆性强、产量潜力大的高光效C4作物，具有粮食、饲料、能源等多种用途，在干旱半干旱中低产地区发挥重要作用。蔗糖代谢是植物最重要的代谢之一，在糖感知和生长发育中发挥重要作用，转化酶基因是蔗糖代谢的关键调节基因，而可溶性酸性转化酶(SAI)是蔗糖代谢途径中的关键酶，对植物生长发育起着至关重要的调节作用，开发简捷快速克隆可溶性酸性转化酶基因的方法，对于育种材料和品种资源的基因分型具有重要意义。

目前，已有包括甜高粱在内的大量关于转化酶基因的研究，并进行了基因克隆。基因克隆方法主要有功能克隆，PCR扩增，定位克隆，差别杂交和减法杂交等多种方法。越来越多基因的克隆和植物基因组的测序，使得同源PCR克隆，成为一种快速、简便克隆植物基因的方法，其在功能标记开发中发挥了重要作用。刘洋(2009)在高粱基因组测序公布之前利用同源PCR克隆技术克隆了甜高粱SAI-1基因大部分片段。后与高粱基因组序列比对发现，已克隆的SAI-1基因片段之前恰好是一段序列空白。之后在空白片段两端设计引物，改变PCR参数，克隆出这段空白片段，同时采用RT-PCR方法克隆了该基因的cDNA全长。但由于该基因全长是分成五段后克隆、测序后拼接而成，要克隆更多高粱材料的SAI-1基因，这种方法显然不合适，因此目前需要一种更为简便的方法，为研究高粱SAI-1基因优异单体型发掘和分子育种、种质创新提供技术支持。

发明内容

为了满足上述领域的需求，本发明提供一种用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1的方法，所述方法将SAI-1基因分为不均等的两段，采用两对引物分别进行PCR，然后再拼接获得SAI-1基因全长。

本发明请求保护的技术方案如下：

用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1的引物，其核苷酸序列为：

SAIA-F/SAIA-R：CCTCCCATCCTTGATTCTCTT/TTGGGATCGTTCATCCAGTTC；

SAIP-F/SAIP-R：GTGGAGCAATGCGATGCTGC/CAGCATCAGATGTCCGTGACC。

用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1前半段序列的引物，其核苷酸序列为：

SAIA-F/SAIA-R：CCTCCCATCCTTGATTCTCTT/TTGGGATCGTTCATCCAGTTC。

用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1后半段序列的引物，其核苷酸序列为：

SAIP-F/SAIP-R：GTGGAGCAATGCGATGCTGC/CAGCATCAGATGTCCGTGACC。

用于克隆高粱可溶性酸性转化酶基因SAI-1的方法，包括如下步骤：

(1)以待测高粱品种为材料，提取样品基因组DNA；

(2)采用权利要求2所述的引物SAIA-F/SAIA-R，以样品基因组DNA为模板进行PCR反应A，获得扩增产物；若扩增产物中出现大小为635bp片段，则回收、克隆、测序该635bp片段，即SAI-1基因的前段；

(3)采用权利要求3所述的引物SAIP-F/SAIP-R，以样品基因组DNA为模板进行PCR反应B，获得扩增产物；若扩增产物中出现大小为3232～3412bp之间的单一片段，则回收、克隆、测序所述单一片段，为SAI-1基因的后段；

(4)将获得的所述SAI-1基因的前段和所述SAI-1基因的后段进行序列拼接，获得待测高粱品种的可溶性酸性转化酶基因全长。

所述PCR反应A的体系为：反应的总体积50μl，其中2×PCR Buffer for KOD FX 25μl，2mmol/L dNTPs 10μl，ddH₂O 10μl，10μmol/L引物SAIA-F/SAIA-R各1.5μl，KOD FX 1μl，样品基因组DNA 1μl。

所述PCR反应A的程序为：94℃预变性2min；98℃10s，61℃30s，68℃30s，30个循环；68℃延伸10min。