[发明专利]一种尿微量白蛋白检测方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，提供一种尿微量白蛋白(mAlb)的定量检测方法。

背景技术：

微量白蛋白尿是指在尿中出现微量白蛋白。白蛋白是一种血液中的正常蛋白质，但在生理条件下尿液中仅出现极少量白蛋白。微量白蛋白尿反映肾脏异常渗漏蛋白质。尿微量白蛋白的增高多见于糖尿病肾病、高血压、妊娠子痫前期，是肾损伤的早期敏感指标。无论哪种疾病引起的尿微量白蛋白都是因起始原因不同造成的肾脏固有细胞的损伤，使肾脏固有细胞的结构发生改变，功能随结构的变化而变化，在尿液中的体现。当发现尿微量白蛋白在20mg/L-200mg/L范围内，尿常规尿蛋白的显示为阴性(-)或(+-)，就属于微量白蛋白尿，说明肾脏已经损伤。而当尿中微量白蛋白超过200mg/L时，尿常规测试尿蛋白阳性(+)-(+++)，此时证明机体已有大量白蛋白漏出，可能出现低蛋白血症，肾病发展离不可逆期只有一步之遥，如果不及时进行医治，就会进入尿毒症期。临床检查内容一般包括免疫功能障碍评估，炎症状态监测，心血管风险评估和类风湿性关节炎及链球菌感染等各个方面。

微量白蛋白尿也是整个血管系统改变的征象，并可认为是动脉病变的“窗口”，因为它是肾脏和心血管系统改变的早期指征。

尿微量白蛋白可通过免疫浊度法，免疫荧光法，放射免疫法，酶免疫法等多种方法进行测定。放射免疫法敏感度高，特异性强，但具有放射性污染，试剂保存期短等缺点。国内目前采用最多的尿微量白蛋白检测方法仍为ELISA法，但酶标法的操作步骤多，故重复性较差。白蛋白致敏羧化聚苯乙烯胶乳，建立免疫胶乳凝集抑制试验以测定尿微量白蛋白，具有快速、特异、简便、价廉的优点。

发明内容：

本发明的目的在于，通过化学交联法大量制备mAlb抗体胶乳试剂，以提高尿微量白蛋白检测效率，增强检测准确性。

本发明的技术方案：应用化学方法交联，通过水溶性碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使羊抗人mAlb抗体与羧化聚苯乙烯胶乳共价交联，制备mAlb抗体胶乳试剂。具体操作如下：

mAlb抗体胶乳试剂的制备：

1.相关缓冲液的准备

0.01mol/L，PH7.2PBS缓冲液的准备：取800ml去离子水溶解8g氯化钠，0.2g氯化钾，1.44g磷酸一氢钠和0.24g磷酸二氢钾，0.1％盐酸调PH至7.2，用去离子水定容至1L，15psi湿热灭菌20min。

0.01mol/L，PH7.6PBS缓冲液的准备：取800ml去离子水溶解8g氯化钠，0.2g氯化钾，1.44g磷酸一氢钠和0.24g磷酸二氢钾，0.1％盐酸调PH至7.6，用去离子水定容至1L，15psi湿热灭菌20min。

2.mAlb抗体胶乳试剂的配制

原料：在粒径为200nm，浓度为10％羧化聚苯乙烯胶乳10ml中，加入0.01mol/L，PH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)10ml，NHS20mg与EDC60mg，室温搅动30min后，37℃恒温水浴反应1小时，2-8℃离心(11000rpm，30min)，倾去上清液，用0.01mol/L，PH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)恢复至原体积。加入500mg/L羊抗人mAlb抗体溶液2.0ml，NHS30mg与EDC120mg，室温搅动30min后，37℃恒温水浴反应2小时，加入0.4mol/L、PH8.2甘氨酸溶液2.0ml反应20min进行淬灭。2-8℃离心(11000rpm，30min)，倾去上清液，用0.01mol/L，PH7.6磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后，用同样的缓冲液配成浓度为1％胶乳试剂，以0.1％(重量体积比)叠氮钠溶液防腐，即为mAlb抗体胶乳试剂。

本检测方法的原理为将羊抗人mAlb抗体交联于胶乳微粒上，与待测尿液样品中的微量白蛋白发生抗原-抗体反应，引起微粒凝集，形成一定的浊度，在340nm波长下，通过同样处理的校准品对照，定量检测出样品中微量白蛋白的含量。

附图说明：

图1：分别采用本发明试剂与市售试剂A，采用奥林巴斯5400全自动生化分析仪，对50份尿液样本(包含正常和异常样本)，按各自参数进行测定，并对测定值进行相关分析。其中X轴表示的是本发明试剂的测定值，Y轴表示的是市售试剂A的测定值。相关系数：r²＝0.9960，线性方程为：y＝1.005x+0.041。

具体实施方式：

实施例