[发明专利]分子标记法检测水稻温敏雄性不育tms9-1基因的方法

权利要求书

1.分子标记法检测水稻温敏雄性不育tms9-1基因的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1）提取待测样品的DNA， 采用分子标记QY-1进行PCR扩增，分子标记QY-1的引物对为：QY-1F：5′-GTGGACACGGCGAGGAAGGGCCAC-3′；QY-1R：5′-CGAGCATGAAGCGGAGGAGGTCCCCG-3′；PCR扩增条件为95℃预变性3min、95℃变性30 sec、60℃退火30 sec、72℃延伸30 sec，共35个循环，最后72℃延伸5 min；

2）PCR反应产物用于Sma1酶切反应，酶切方法为：PCR反应产物10μl、Sma1限制性内切酶0.5μl，浓度为1 U/μl、10×FastDigest buffer 2μl，去离子水7.5μl，酶切反应在30℃水浴锅中温浴20 min，加入4μl 6×loading buffer后于3%琼脂糖凝胶120U电压电泳30 min，在Tanon2500凝胶成像仪进行拍照；

3）待测DNA样品经过PCR扩增和Sma1酶切后，电泳方式能检测出259bp片段的含tms9-1基因的水稻材料，而片段大小为286bp的则是无tms9-1基因的水稻材料。

2.根据权利要求1所述的分子标记法检测水稻温敏雄性不育tms9-1基因的方法，其特征在于待测样品的DNA的提取方法如下：

1）取2 cm长的水稻叶片放入2 ml离心管中，加入液氮后将水稻叶片磨碎，再加入500 μl 2％的CTAB提取液，CTAB: 2 g，放于75℃水浴30 min ；100 ml CTAB提取液包括以下的组分：1 mol/L Tris-Hcl pH8.0 10 ml; 0.5 mol/L EDTA pH8.0 4 ml; Nacl: 8.12 g；

2）加入等体积氯仿/异戊醇充分振荡后，氯仿/异戊醇的体积比为24:1，放入离心机中12,000 rpm离心10 min，静止5 min后吸取500 μl 上清液于1.5 ml离心管；

3）加入等体积预冷的异丙醇后上下混匀，放入离心机中12,000 rpm离心10 min；

4）弃上清液并加入500 μl 70％的乙醇进行洗涤；12,000 rpm离心5min弃上清液后可见DNA的白色沉淀；

5）室温干燥10-20 min后，加入500 μl 去离子水溶解。

3.一种与水稻温敏雄性不育tms9-1基因完全连锁的dCAPS分子标记QY-1，其特征在于，该分子标记的引物对为：QY-1F：5′-GTGGACACGGCGAGGAAGGGCCAC-3′；QY-1R：5′-CGAGCATGAAGCGGAGGAGGTCCCCG-3′。