[发明专利]分子标记法检测水稻温敏雄性不育tms9-1基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及水稻品种资源特性的检测技术，尤其涉及一种分子标记法检测水稻温敏雄性不育tms9-1基因的方法及其分子标记。

背景技术

水稻温敏雄性不育系为利用两系法实现水稻杂种优势利用的重要种质资源，其在高温长日照条件下表现为雄性不育，可用于生产杂交种子；而在低温短日照条件下又表现为雄性可育，可用于自交繁殖。相对于三系杂交稻而言，两系杂交水稻以生产程序简化、杂交配组自由、能够克服三系不育细胞质负效应和容易实现籼粳亚种间杂种优势利用等特点而得到广泛利用。水稻tms9-1基因调控温敏雄性不育系衡农S-1的温敏雄性不育性状，OsMS1基因被鉴定为其候选基因。在衡农S-1温敏雄性不育系中OsMS1基因内部发生一个从T到C的单碱基突变，利用该碱基突变结合PCR和限制性内切酶的酶切技术可以发展出一种新的dCAPS分子标记，该标记与温敏雄性不育tms9-1基因完全连锁，可用于tms9-1基因的检测、tms9-1基因的分子标记辅助选择和转育等用途。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供一种分子标记法检测水稻温敏雄性不育tms9-1基因的方法，本发明的第二个目的是提供上述的方法采用的分子标记。本发明的检测方法准确性好、操作简单、成本低廉、实用性强。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

分子标记法检测水稻温敏雄性不育tms9-1基因的方法，该方法包括以下的步骤：

1）提取待测样品的DNA， 采用分子标记QY-1进行PCR扩增，分子标记QY-1的引物对为：QY-1F：5′-GTGGACACGGCGAGGAAGGGCCAC-3′；QY-1R：5′-CGAGCATGAAGCGGAGGAGGTCCCCG-3′；PCR扩增条件为95℃预变性3min、95℃变性30 sec、55℃退火30 sec、72℃延伸30 sec，共35个循环，最后72℃延伸5 min；

2）PCR反应产物用于Sma1酶切反应，酶切方法为：PCR反应产物10μl、Sma1限制性内切酶0.5μl，浓度为1 U/μl、10×FastDigest buffer 2μl，去离子水7.5μl，酶切反应在30℃水浴锅中温浴20 min，加入4μl 6×loading buffer后于3%琼脂糖凝胶120U电压电泳30 min，在Tanon2500凝胶成像仪进行拍照；

3）待测DNA样品经过PCR扩增和Sma1酶切后，电泳方式能检测出259bp片段的含tms9-1基因的水稻材料，而片段大小为286bp的则是无tms9-1基因的水稻材料。

作为优选，所述的待测样品的DNA的提取方法如下：

1）取2 cm长的水稻叶片放入2 ml离心管中，加入液氮后将水稻叶片磨碎，再加入500 μl 2％的CTAB提取液，CTAB: 2 g，放于75℃水浴30 min ；100 ml CTAB提取液包括以下的组分：1 mol/L Tris-Hcl pH8.0 10 ml; 0.5 mol/L EDTA pH8.0 4 ml; Nacl: 8.12 g；

2）加入等体积氯仿/异戊醇充分振荡后，氯仿/异戊醇的体积比为24:1，放入离心机中12,000 rpm离心10 min，静止5 min后吸取500 μl 上清液于1.5 ml离心管；

3）加入等体积预冷的异丙醇后上下混匀，放入离心机中12,000 rpm离心10 min；

4）弃上清液并加入500 μl 70％的乙醇进行洗涤；12,000 rpm离心5min弃上清液后可见DNA的白色沉淀；

5）室温干燥10-20 min后，加入500 μl 去离子水溶解。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种与水稻温敏雄性不育tms9-1基因完全连锁的dCAPS分子标记QY-1，该分子标记的引物对为：QY-1F：5′-GTGGACACGGCGAGGAAGGGCCAC-3′；QY-1R：5′-CGAGCATGAAGCGGAGGAGGTCCCCG-3′。