[发明专利]产γ‑氨基丁酸的重组菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中产γ-氨基丁酸的重组菌及其构建方法与应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，广泛存在于微生物，植物和动物细胞中。GABA是哺乳动物中枢神经系统的抑制性神经递质，具有降血氨，抗焦虑，降血压，治疗糖尿病，促进酒精代谢，改善肾机能和肝功能以及消臭、减肥等生理功能，广泛应用于食品保健、医药和饲料行业中。此外，GABA还可聚合形成尼龙4，在化工行业也具有良好的应用前景。

目前GABA大规模制备的理想途径是采用微生物(酶)法转化L-谷氨酸或其钠盐。微生物转化法制备GABA的关键是要获得具有高谷氨酸脱羧酶活力的菌株。利用大肠杆菌高效异源表达谷氨酸脱羧酶基因是一个非常有效的方法，已有相关专利报道(申请号：201010567447.9；201110289796.3；201210431917.8)。然而这些专利采用的是Novagen的pET-28a(+)表达载体。pET-28a(+)表达载体的乳糖操纵子，蛋白表达不够严谨且需要将细胞培养至一定浓度后再添加诱导物，生产工艺较难控制；采用的高拷贝复制起始位点和强T7启动子使细菌表达许多包涵体蛋白且诱导物IPTG具有强细胞毒性，菌体细胞和活性蛋白得率低。鉴于此，开发产量高、可重复使用、生产工艺简单、成本低、易于工业化大规模生产的新的表达系统是十分必要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备高产量、生产工艺简单和成本低的γ-氨基丁酸。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了产γ-氨基丁酸的重组菌的构建方法。

本发明所提供的产γ-氨基丁酸的重组菌的构建方法，包括将谷氨酸脱羧酶B基因导入受体菌得到产γ-氨基丁酸的重组菌；所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌；

所述谷氨酸脱羧酶B基因编码a1或a2的蛋白质：

a1、氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

a2、在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有谷氨酸脱羧酶B活性的由a1衍生的蛋白质。

上述方法中，所述突变型大肠杆菌为下述B1至B7中的任一种：

B1、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行下述b1-b3的改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(该改造以“ΔgadABC”表示)；

b1、将谷氨酸脱羧酶A基因敲除，该改造以“△gadA”表示；

b2、将所述谷氨酸脱羧酶B基因敲除，该改造以“△gadB”表示；

b3、将谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因截短得到谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白截短突变体基因，具体可为截短所述谷氨酸：γ-氨基丁酸反向转运蛋白的羧基端部分氨基酸的编码序列，该改造以“△gadC”表示；

B2、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b1改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(该改造以“ΔgadA”表示)；

B3、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b2改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(该改造以“ΔgadB”表示)；

B4、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b1和所述b2改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(该改造以“ΔgadAB”表示)；

B5、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b3改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(该改造以“△gadC”表示)；

B6、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b1和所述b3改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(该改造以“△gadAC”表示)；

B7、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述b2和所述b3改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(该改造以“△gadBC”表示)。

上述敲除和截短均可通过同源重组实现。

上述方法中，所述谷氨酸脱羧酶A基因编码c1或c2的蛋白质：

c1、氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；

c2、在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有谷氨酸脱羧酶A活性的由c1衍生的蛋白质；