[发明专利]一种人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的定量测定方法、试剂及试剂盒

说明书

技术领域

本申请涉及一种人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的定量测定方法、试剂及试剂盒。

背景技术

天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)广泛存在于人体各种组织细胞中，尤以肝、心组织细胞含量最为丰富，而正常人血清中AST活性很低。人体中AST存在两种同工酶，一种是cAST，主要来源于细胞浆，另一种是mAST，存在于线粒体内。这两种同工酶在基因组成上有差异，在氨基酸组成、免疫学特性以及在体内的半衰期等均不同。

在机体轻度病变时，组织细胞的细胞膜通透性增高，cAST透过细胞膜进入血液系统中，但mAST有两层线粒体膜的保护，不易释放入血；而当机体严重疾病时，出现细胞坏死、线粒体崩解，附着在线粒体上的mAST可迅速释放进入血中。因此，血清mAST活性可反映组织细胞的坏死程度，若血清中检测出高水平mAST，则表明心肌、肝脏严重受损；另外mAST在血中的半衰期比cAST短，当细胞不再破坏或修复时，血清中mAST很快降至正常水平，因此mAST又是心肌、肝脏损害预后的评价指标，对疾病的诊断、治疗具有重要的价值。

目前，血清中mAST测定主要有电泳法、层析法以及免疫抑制法等。这些方法具有操作繁琐、耗时长、价格昂贵、过度浪费资源的缺点，不适于常规检验，尤其是大规模流行病学检查或临床大批量标本诸多项目的同时检测。

发明内容

本申请的目的是提供一种人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性定量测定方法、试剂及试剂盒。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的试剂，该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成，其中，所述试剂I含有Tris缓冲液、L-天门冬氨酸、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、c-AST羊抗人抗体、酶稳定剂；所述试剂II含有α-酮戊二酸、还原性辅酶。

进一步的，所述试剂I中Tris缓冲液含量为50-150mmol/L，L-天门冬氨酸含量为100-500mmol/L，苹果酸脱氢酶含量为0.5-2KU/L，乳酸脱氢酶含量为0.2-1.5KU/L，c-AST羊抗人抗体含量为0.5-1.5ml/L，酶稳定剂含量为0.5-5g/L。

进一步的，所述试剂I中Tris缓冲液含量为100mmol/L，L-天门冬氨酸含量为240mmol/L，苹果酸脱氢酶含量为1KU/L，乳酸脱氢酶含量为0.8KU/L，c-AST羊抗人抗体含量为0.8ml/L，酶稳定剂含量为1g/L。

进一步的，所述试剂II中α-酮戊二酸含量为1-50mmol/L，还原性辅酶含量为0.05-1mmol/L。

进一步的，所述试剂II中α-酮戊二酸含量为10mmol/L，还原性辅酶含量为0.2mmol/L。

进一步的，所述Tris缓冲液PH为8.0。

进一步的，所述酶稳定剂包括海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、甘油、吐温80中的一种或者几种；

进一步的，所述还原型辅酶Ⅰ稳定剂包括海藻糖、牛血清白蛋白、甘油、吐温80中的一种或几种。

本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的试剂盒，其中装有上述定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的试剂，该试剂由分别放置的试剂I及试剂II组成。

本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的方法，该方法包括向血清样品中加入所述试剂I，37℃孵育5分钟，然后向样品中加入试剂II，继续孵育1-2分钟后，在340nm波长下连续监测1-2分钟样本吸光度变化，计算样本每分钟平均吸光度变化值△A_样本/min；用同样的方法测定空白管每分钟平均吸光度变化值△A_空白/min；再通过下式(1)计算得到血清样品的线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性：

m-AST活性(U/L)＝(△A_样本/min-△A_空白/min)×K   (1)

K＝2090

本方法的原理为：血清中天门冬氨酸氨基转移酶的活性为胞浆型AST(c-AST)和线粒体型AST(m-AST)之和。本法用免疫抑制法酶动力学测定m-AST活性，在羊抗人的c-AST抗体存在的条件下，标本中c-AST活性被抑制，而m-AST活性不受影响。可用速率法进行测定，标本中m-AST的活性与NADH下降的速率呈正比。