[发明专利]一种罗汉果种质资源离体保存的方法及保存后恢复生长的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术，具体涉及一种罗汉果种质资源离体保存的方法及保存后恢复生长的方法。

背景技术

罗汉果(Siratia grosvenorii(Swingle)C.Jeffrey)属葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属植物，为多年生草质藤本植物，雌雄异株，冬季茎蔓枯死，以块茎过冬。罗汉果的果实是我国的传统中药，具有清热解毒、止咳润肺等功效。罗汉果果实中含有甜度极高的葫芦烷三萜类物质(罗汉果甜甙)，其中罗汉果甜甙Ⅴ的甜度约为蔗糖的300倍，是果实中主要的甜味成分，无毒，不含热量，可作为食品、饮料的甜味剂，也是糖尿病人理想的食糖代用品。

近十年来，罗汉果育种工作者利用组织培养技术建立起了高效的无性快繁体系，为广大种植户提供大量优质脱毒种苗，给罗汉果产业带来了新的生机。现有罗汉果试管苗抗病能力较弱，容易感染花叶病毒和根结线虫等，冬季采收块茎留种会导致次年产量和品质下降。而在组培过程中，需要对罗汉果试管苗进行频繁的继代培养(40～60d继代一次)才能保持其正常生长。试管苗的培养时间过长和继代次数过多，则容易发生遗传变异，如再作为次年大量生产的原种，必将影响果实的产量和品质。因此，为了保证种苗的优良品性，育种工作者需要在每年取材，重新建立离体快繁体系，这样则需要浪费较多的时间、人力和物力。

种质资源离体保存包括常温限制生长保存、低温保存和超低温保存三种方法，具有建立种质圃、种质库、田间种植保存等方法不可比拟的优势，既可节省空间、人力、物力和土地，又可避免自然灾害引起的种质丢失，在需要时可以用离体培养方法很快大量繁殖。刘华英等(罗汉果试管苗茎尖玻璃化法超低温保存及植株再生，中草药，第40卷第2期，2009年2月)曾报道了罗汉果种质资源的超低温保存方法，但该方法的实施需要特殊的保存设备，而且操作过程复杂，难以推广应用。至今，尚未见有在常温条件下罗汉果种质资源离体保存的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种罗汉果种质资源离体保存的方法及保存后恢复生长的方法。该保存方法实现了罗汉果种质资源在常温条件下的离体保存，保存的时间可达12～24个月，离体保存后的材料可快速恢复生长，并进行大量繁殖。

本发明所述的罗汉果种质资源离体保存的方法，包括获得脱毒试管苗的步骤和微型块茎的形成、膨大与离体保存步骤，所述的微型块茎的形成、膨大与离体保存步骤是将获得的脱毒试管苗继代培养20～40天后，切除叶片和顶芽，所得枝条分切成带1～3个节的茎段；所得茎段转接入种质保存培养基中培养60～90天，即有微型块茎形成，所形成的微型块茎继续在种质保存培养基中膨大和保存；其中：

所述的种质保存培养基配方为：(1/4～1)MS+6-BA0.01～3.0mg/L+NAA0.01～0.1mg/L+琼脂5～10g/L+蔗糖30～90g/L+多效唑0.1～3.0mg/L或矮壮素100～1000mg/L。

上述离体保存方法中，所述获得脱毒试管苗的步骤与现有常规技术相同。

上述离体保存方法中，所述的种质保存培养基配方优选为：(1/4～1)MS+6-BA0.1～0.5mg/L+NAA0.02～0.05mg/L+琼脂6～8g/L+蔗糖45～75g/L+多效唑0.5～2mg/L或矮壮素300～700mg/L。最佳的选择为：1/2MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+琼脂7g/L+蔗糖60g/L+多效唑1mg/L或矮壮素500mg/L。所述种质保存培养基的pH值为5.5～7.0，优选为5.8～6.0。

上述离体保存方法中，所述茎段转接入种质保存培养基中培养的条件，以及微型块茎继续在种质保存培养基中膨大和保存的培养条件相同。在本申请中，优选是将茎段转接入种质保存培养基中培养的条件，以及微型块茎继续在种质保存培养基中膨大和保存的培养条件均设置为：温度为20～35℃，光照时间为8～14h/d，光照强度为1500～3000lx；更优选设置为：温度为22～27℃，光照时间为10～12h/d，光照强度为1500～2500lx。

上述离体保存方法中，在将茎段转接入种质保存培养基中按上述条件培养60～90天时，即每个茎段上至少有1～2个微型块茎形成，所形成的各微型块茎的直径通常在2.0～5.0mm范围内。

本发明还包括采用上述罗汉果种质资源离体保存后恢复生长的方法，具体包括：取出离体保存后的材料，切取微型块茎转入恢复生长培养基中培养30～40天，获得恢复生长的芽苗；所得芽苗按常规方法进行增殖培养和生根培养，即可获得完整小植株；其中：