[发明专利]一种定量分析微量血干血滤纸片上视黄醇及其前体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微量血干血滤纸片中视黄醇及其前体的分析检测方法。

背景技术

血液中视黄醇均需从动植物食品中摄入，由其前体物质：β-胡萝卜素、视黄醇乙酸酯和视黄醇棕榈酰酯在肠粘膜和肝细胞中转化形成，共同存在于血液中。只有综合视黄醇及其前体的含量信息才能全面衡量体内视黄醇的水平。

目前，普遍采用用荧光、紫外线分光光度法和高效液相色谱仪(High performance liquid chromatography，HPLC)定量分析血清或血浆中视黄醇，前两种方法萃取步骤繁琐，结果受杂质影响大；而HPLC法可对血清中复杂组分进行分离，其检测敏感性与特异性相对较高，但多数仅开发了检测视黄醇的方法，少有分析其多种前体的方法。

此外，以上技术所需静脉血量均较大，约1-2ml，对于人群则必须抽取静脉血，对于实验动物也须取静脉血，有的甚至需处死后取血，无论对于人群，还是对于动物，其依从性均较差，且标本不便于远距离运送，这为分析人群和动物模型视黄醇及其前体水平，研究其生理病理功能带来较大困难。Whatman滤纸片能稳定、均一、定量吸附血液，是一款通过美国FDA验证通过的体外二级诊断用产品。通过采集微量血，吸附于Whatman滤纸片上，形成干血滤纸片，以便于标本的采集、保存和运输，也可弥补基层或部分缺乏高端检测仪器及其操作人员的不足而不能分析视黄醇水平，同时已证实视黄醇可稳定存在干血滤纸片中。因此，采集微量血制成干血滤纸片是广泛分析人群和动物模型视黄醇水平的理想标本。然而，这种标本血液标本甚少(约10μL)，且在其中的含量甚微，而传统HPLC的灵敏度相对低，不能分析。目前国际、国内仍缺乏分析利用干血滤纸片定量分析视黄醇及其前体的方法。

串联质谱(tandem mass spectrometry，MS/MS)仪具有高选择性、高灵敏度的优势，是近年来飞速发展的技术，与HPLC对复杂样品的高分离浓缩、高通量能力的优点结合起来，对微量生物样品多组分同步分析具有突出优势，为解决这一技术难题提供了可能。但文献中对串联质谱中分析视黄醇及其前体的各项参数报道较少，且仪器厂家、型号的差异，导致没有现成的检测参数可以采用，必须根据本研究单位自己优化确定。此外，HPLC对视黄醇及其前体的分离方法的报道也较少，且分析时间较长，约30min，不利于大样本分析。同时，提取干血滤纸片视黄醇及其前体的方法尤为重要，是能有效检测的前提，它将影响整个方法的灵敏度。但目前国际、国内仍缺乏分析从干血滤纸片中提取视黄醇及其前体的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定量分析微量血干血滤纸片中视黄醇及其前体的方法。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种检测视黄醇及其前体的方法，包括以下步骤：

(1)从样品中萃取视黄醇和/或其前体；

(2)HPLC分离视黄醇和/或其前体；

(3)MS/MS定量检测；

所述样品是干血滤纸片标本，采用的萃取剂为三氯甲烷。

上述萃取步骤包括蛋白变性步骤，采用试剂为含有0.1％BHT和0.025mmol/L KOH的甲醇。

上述从样品中萃取视黄醇和/或其前体包括以下步骤：

①血片溶解：将载有微量血的干血滤纸片用打孔器打出直径3.2mm(即3.2μl的全血)圆形滤纸血片，置于1.5ml EP管中，加入100μl含0.1％BHT作为抗氧化剂的去离子水，室温振摇，1000rpm，2min，充分溶解血液；

②蛋白变性：取步骤①所得血斑标本，加入200μl含有0.1％BHT和0.025mmol/L KOH的甲醇变性沉淀蛋白质，漩涡震荡2min；

③萃取：以300μl三氯甲烷作为萃取剂，取步骤②所得的所有溶液，在其中加入萃取剂，室温振摇2min，离心13200rpm，8min；

④小心吸取含视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酰酯、β-胡萝卜素的有机溶剂层(底层)180μl，氮气吹干。加入100μl流动相充分溶解。HPLC-MS/MS上机检测。

上述HPLC分离视黄醇和/或其前体步骤中，采用C8色谱柱，甲醇∶CH₂CL₂＝95∶5(v/v)为流动相，以0.2ml/L等度流速，保持柱温20℃进行液相分离。

上述MS/MS定量检测步骤中，以APCI离子源作为离子源，MRM质谱检测参数采用表1所示。

表1 MS/MS定量检测优化参数