[发明专利]一种以胆固醇为配基的高效疏水相互作用色谱填料制备与应用

权利要求书

1.结构式(I)所示高效疏水相互作用色谱填料

其中，R基团可以是：CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂CH(CH₃)₂，CH(CH₃)CH₂CH₂COOH，CH(CH₃)CH₂CH₂CH(CH₂CH₃)CH(CH₃)₂，CH(CH₃)CH₂CH₂CHC(CH₃)₂等。

2.权利要求1高效疏水相互作用色谱填料结构式(I)中的色谱配基为胆固醇类衍生物即环戊烷多氢菲的衍生物，如胆固醇；

3.权利要求1所述的高效疏水相互作用色谱填料制备方法，包括以下步骤：

(1)将硅烷偶联剂与活化硅胶反应得到环氧基硅胶；

(2)将环氧基硅胶与胆固醇以及胆固醇类衍生物反应得到高效疏水相互作用色谱填料；

(3)将环氧基硅胶与含有羧基的胆固醇类衍生物反应得到具有高效疏水相互作用/弱阳离子交换作用色谱填料；

4.根据权利要求3所述高效疏水相互作用色谱填料制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)所用的活化硅胶经1∶10～1∶20(g/mL，m/v)15～20％盐酸活化2～6小时，用蒸馏水洗至中性，100～150℃真空干燥12～24小时。其孔径在之间，粒径为5～10μm的球状多孔硅胶。

(2)按照1∶1～1∶2(g/mL，m/v)将干燥的活化硅胶和硅烷偶联剂分别加入装有NaAc缓冲液的三颈圆底烧瓶中，调节温度80～90℃，机械搅拌反应3～5h，然后依次用NaAc缓冲液、甲醇、水依次洗涤干净，真空干燥即可得到环氧基硅胶。

所述NaAc缓冲溶液浓度为45～55mmol/L，pH值为4.5～6.5。

(3)按照1∶0.5～1∶1(g/g，m/m)将干燥的环氧基硅胶和胆固醇或胆酸分别加入到干燥三颈瓶中，再依次加入1∶1∶0.1(mL/mL/mL，v/v/v)的无水乙醚、干燥的1，4-二氧六环以及三氟化硼乙醚，在4～5℃条件下机械搅拌反应3.5～4.5h。反应结束之后分别用无水乙醚、丙酮、甲醇、水清洗填料，真空干燥得到色谱填料。

5.权利要求1所述的高效疏水相互作用色谱填料在变性蛋白的复性与纯化应用，其特征在于

(1)将该色谱填料用于还原变性的溶菌酶的复性与纯化。当在流动相中添加了2.0～3.0mol/L脲时，其质量回收率及活性回收率分别为80～90％和95～98％。

(2)将该色谱填料用于重组人酪氨酸激酶配体(Recombined human Flt3 ligand，rhFL)的复性与纯化。将rhFL变性抽提液直接进样至流动相A平衡的色谱柱中，在优化色谱条件下，采用0-100％流动相B的30min线性梯度洗脱，得到的目标峰馏分质量回收率为45～50％，纯度为95～97％，生物比活为7.2～8.0×10⁸IU/mg。

(3)将该色谱填料用于重组人干细胞因子(Recombined human stem cell factor，rhSCF)的复性与纯化。将rhSCF变性抽提液直接进样至流动相A平衡的色谱柱中，在优化色谱条件下，采用0-100％流动相B的30min线性梯度洗脱，得到的目标峰馏分纯度为95～98％，质量回收率为55～65％，生物比活为1.1～1.3×10⁶IU/mg。

(4)所述的流动相A为2.5～3.0mol/L(NH₄)₂SO₄，20.0～50.0mmol/L KH₂PO₄，pH 7.0～7.4；流动相B为20.0～50.0mmol/L KH₂PO₄，pH 7.0～7.4；或者所述的流动相A分别为2.5～3.0mol/L(NH₄)₂SO₄，20.0～50.0mmol/L KH₂PO₄，2.5～3.5mol/L Urea，pH 7.0～7.4；流动相B为20.0～50.0mmol/L KH₂PO₄，2.5～3.0mol/L Urea，pH 7.0～7.4。

(5)所述的流动相A和流动相B或称为平衡缓冲液和洗脱缓冲液，不同是均添加2.5～3.0mol/L Urea。