[发明专利]一种以胆固醇为配基的高效疏水相互作用色谱填料制备与应用

说明书

发明领域

本发明涉及一种以胆固醇为配基的高效疏水相互作用的色谱填料的制备方法及其用于蛋白质复性与纯化，属于高效液相色谱技术和生物工程技术交叉领域。

背景技术

胆固醇是生物膜上的主要组成部分。在HPLC中，以胆固醇分子作为色谱配基，采用表面化学修饰合成色谱填料引起了色谱工作者的极大兴趣，并取得一定的进展[Witkiewicz Z.，Mazur J.LC GC，1990，8(3)：224-236；Pesek J.J.，Matyska M.T.Interface Science，1997，5(2)：103-117]。已有的文献报道，以胆固醇为配基的色谱填料主要集中于反相液相色谱(RPLC)研究，其高效分离性能已得到验证和应用[Soukup J.，Jandera P.Journal of Chromatography A，2012，1228：125-134]。对于具有活性功能的蛋白质而言，RPLC仅用于蛋白质分析。

而与反相液相色谱法机理相同的疏水相互作用色谱(HIC)是采用流动相为盐-水洗脱体系，色谱条件温和，被广泛应用于天然活性蛋白质分离和变性蛋白的复性与同时纯化。目前，在HIC中应用最多的配基有两类：一类是线性链烷基(如丁基或辛基)和芳香基团(如苯基)，另一类是疏水性温和的配基有聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)等[Hubert P.，et al.Joumal of Chromatography A，1991，539(2)：297-306]。前者配基所构成的填料容易导致蛋白质，尤其是变性蛋白难以洗脱。后者疏水性弱的配基在变性蛋白复性过程中，会造成吸附载量下降、变性蛋白易于直接穿透的缺点，从而使蛋白质的复性效率很低。

本发明以胆固醇分子作为色谱配基，制备一种硅胶基质的高效疏水相互作用色谱填料，并将该填料应用于天然蛋白质的分离和变性蛋白的复性与纯化。

发明内容

本发明的目的在于将细胞膜上的两性功能分子胆固醇作为色谱填料配基，制备一种具有特殊功能的硅胶基质HPHIC填料，并对还原变性溶菌酶、重组人Flt3ligand(FL)包涵体和重组人干细胞因子(rhSCF)进行复性与同时纯化，以期克服HPHIC配基在变性蛋白复性与纯化中由于其疏水作用较强或较弱会造成吸附载量过强或下降、变性蛋白难于洗脱或易于直接穿透的缺点。

为了实现上述任务，本发明采取解决技术方案如下：

1.以空白基质为原材料，以胆固醇及其衍生物为配基，制备结构式(I)所示胆固醇配基的硅胶基质高效疏水相互作用色谱填料；

其中，R基团为CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂CH(CH₃)₂，CH(CH₃)CH₂CH₂COOH，CH(CH₃)CH₂CH₂CH(CH₂CH₃)CH(CH₃)₂，CH(CH₃)CH₂CH₂CHC(CH₃)₂等。

2、所述结构式(I)的高效疏水相互作用色谱填料制备方法，包括以下步骤：

(1)将硅烷偶联剂与活化硅胶反应得到环氧基硅胶；

(2)将环氧基硅胶与胆固醇以及胆固醇类衍生物反应得到高效疏水相互作用色谱填料；

(3)将环氧基硅胶与含有羧基的胆固醇类衍生物反应得到具有高效疏水相互作用/弱阳离子交换作用色谱填料；

3、所述胆固醇配基的高效疏水相互作用色谱填料制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)所用的活化硅胶经1∶10～1∶20(g/mL，m/v)盐酸活化2～6小时，用蒸馏水洗至中性，100～150℃真空干燥12～24小时。其孔径在之间，粒径为5～10μm的球状多孔硅胶。

(2)按照1∶1～1∶2(g/mL，m/v)将干燥的活化硅胶和硅烷偶联剂分别加入装有NaAc缓冲液的三颈圆底烧瓶中，调节温度80～90℃，机械搅拌反应3～5h，然后依次用NaAc缓冲液、甲醇、水依次洗涤干净，真空干燥即可得到环氧基硅胶。

所述NaAc缓冲溶液浓度为45～55mmol/L，pH值为4.5～6.5。