[发明专利]一种虫草素发酵固体培养基及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种虫草素发酵固体培养基及其制备方法与应用。

背景技术

虫草素是虫草中主要的活性成分之一。虫草素具有多种生物学活性，如抗肿瘤、抗增殖、抗转移、抗菌、抗病毒、免疫调节和抗炎等。虫草素的制备主要有化学合成和生物合成两种方式。由于目前化学合成虫草素生产成本高，合成工艺复杂，收率低，产物纯化比较难，所以虫草素主要由生物合成法制备。生物合成法制备虫草素有两种途径：一是固体发酵获得虫草子实体，再从中提取；二是通过虫草液体发酵，从发酵液中直接提取。由于液体发酵比固体发酵在发酵规模、菌体生长速率、生长密度以及可控性上的优势，虫草液体发酵提取虫草素成为主要的虫草素制备方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可产生大量子实体的虫草素发酵固体培养基。

本发明还要解决的技术问题是提供上述固体培养基的制备方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述固体培养基的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种虫草素发酵固体培养基的制备方法，它包括如下步骤：

1)将葡萄糖40～50g/L，酵母膏3～10g/L，蛋白胨5～15g/L，磷酸二氢钾0.2～1.0g/L，磷酸氢二钾0.2～1.0g/L，硫酸镁0.2～1.0g/L，吐温80 0.5～5.0g/L，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.5～6.0，制得发酵培养液；

2)将步骤1)中的发酵培养液与膨胀珍珠岩混合均匀，经喷雾干燥后装入发酵罐，121℃蒸汽灭菌20min，获得虫草素发酵固体培养基。

步骤1)中，将葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温802g/L，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.8，制得发酵培养液。

步骤2)中，所述的膨胀珍珠岩粒径为4～8mm，优选6mm。

步骤2)中，发酵培养液与膨胀珍珠岩的体积质量比为30～50ml/g，优选40ml/g。

步骤2)中，喷雾干燥后的物料含水量控制在2.5-5ml/g，优选4ml/g。

上述制备方法制备得到的虫草素发酵固体培养基也在本发明的保护范围之内。

上述虫草素发酵固体培养基在发酵生产虫草素中的应用也在本发明的保护范围之内。

具体的应用方法是，将在PDA斜面培养基上长好的蛹虫草菌种用5ml无菌生理盐水洗下，制成菌悬液，接种至灭菌好的装有50ml的发酵培养液摇瓶中，于27℃，180rpm恒温摇床培养4天，加入无菌水450ml，混合均匀后，再以1wt％接种至灭菌好的虫草素发酵固体培养基中，充分搅拌使菌种均匀分布于虫草素发酵固体培养基中，每24h时以1wt％比例补水维持相对湿度，并搅拌翻料，同时从发酵罐底部通入相对湿度为80％的无菌空气，通气比为0.5min^-1，27℃培养4天后，通气比降为0.5h^-1，每5天以5wt％喷淋加入含有0.5g/L腺嘌呤和2～6g/L(优选4g/L)三油酸甘油酯的培养液使其产生大量的子实体，其余条件不变，再培养21天后发酵结束；加入1.5倍固料体积的水，80℃搅拌翻料2h，过滤收集滤液；水煮过程进行三次，合并滤液，浓缩至固料体积，得到虫草素提取液。

上述蛹虫草菌种为任意具有虫草素生产能力的蛹虫草菌种，例如可以是购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC 14014的菌株。

本技术通过培养液在20目膨胀珍珠岩上的吸附，发挥固体发酵的优势，克服其缺陷，利用20目膨胀珍珠岩中丰富的比表面积达到大量生产子实体的目的。众所周知，虫草素通常富集于蛹虫草子实体顶部。

我们通过文献调研和研究发现虫草素的直接前体是腺嘌呤，而虫草素的另一个结构单元是3’-脱氧核糖。在蛹虫草发酵中，我们发现在发酵培养基中加入腺嘌呤能大大提高虫草素产量。而且，我们还发现加入植物油后蛹虫草发酵液中的虫草素含量又有进一步升高。