[发明专利]一种调控和提高脱氧核酶催化活性的方法

说明书

本发明涉及一种调控和提高G‑四聚体脱氧核酶(DNAzyme)‑氯化血红素(hemin)复合物催化双氧水(H₂O₂)氧化2,2’‑联氮‑二(3‑乙基‑苯并噻唑‑6‑磺酸)(ABTS)反应的方法。在本方法中，通过对已知DNAzyme的序列进行拆分，选择出高活性的核酸片段，然后通过与一定长度的多胸腺嘧啶(T)核酸序列将两条高活性的片段进行重组连接，通过调节多T核酸序列的长度即可调控并且有效提高重组DNAzyme的催化活性。

技术领域

本发明涉及一种调控和提高脱氧核酶催化活性的方法，特别涉及一种调控和提高具有G-四聚体结构的脱氧核酶(DNAzyme)-氯化血红素(hemin)复合物催化H₂O₂氧化2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS²⁺)反应的催化活性的方法，属于生物分析技术领域。

背景技术

G-四聚体(G-quadruplex)是指由含有多个连续鸟嘌呤碱基G的DNA或RNA形成的一种特殊的核酸二级结构。它首先由四个G碱基通过Hoogsteen氢键的配对方式首尾连接构成了一个由4个G形成的平面，然后不同平面之间通过π-π堆积作用而形成多层结构，即为G-四聚体。

具有G-四聚体结构的核酸因其高度有序的碱基空间排列结构，具备多种特殊性质和广泛的潜在应用前景。其中，用来调控和稳定线状染色体末端的端粒即是由6个碱基重复序列(TTAGGG)的单链DNA及一些蛋白组合而成。G-四聚体核酸结构及活性的研究对于开发出潜在的新型抗肿瘤药物有重大意义。另外最近在非编码区和多种核酸适配体中也发现了G-四聚体结构。此外，部分具有G-四聚体结构的脱氧核酸具有特别的催化功能，被称为脱氧核酶(DNAzyme)。脱氧核酶相比传统蛋白质酶具有易于化学合成和修饰、热稳定性好、不易水解等优点，因此在生物模拟酶的研究中占有极其重要的地位。

其中有一类DNAzyme在K⁺、Na⁺、NH₄⁺等阳离子存在的条件下形成G-四聚体结构，此时氯化血红素嵌入G-四聚体结构的空穴之中，显著提高氯化血红素(hemin)催化H₂O₂氧化2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS²⁺)或鲁米诺的反应。由于该反应的产物在紫外可见范围内有特征吸收或化学发光，近年来，该类具有过氧化氢酶活性的DNAzyme-hemin复合物被广泛用于一系列高灵敏度、高特异性的化学及生物传感器，用于实现DNA分子(端粒酶活性，单碱基突变)、蛋白(凝血酶)、离子(钾离子、汞离子)等多种分析物的检测分析。

在G-四聚体DNA中，多层结构的形成可以由一条完整的DNA链弯曲结合而成，也可以由多条裂分的多G序列共同组合而成。因此，G-四聚体可分为单链、双链和四链等几种形式。此外，根据多G序列弯曲形成G-四聚体结构时各棱上DNA折叠方向的不同，G-四聚体DNA的结构又可被定义为平行、反平行和混合等模式。不同结构的DNAzyme的过氧化氢酶的活性各异，通常具有平行结构的DNAzyme的活性高于具有反平行结构的DNAzyme。

目前，具有过氧化氢酶活性的脱氧核酶最初由体外筛选技术(SELEX)获得。由于该技术本身的局限性，所获得的脱氧核酶的催化活性有限。近些年来国内外研究人员采用多种不同方法来提高脱氧核酶的催化活性，主要包括下列方法：(1)嫁接法：在原始的脱氧核酶上嫁接上一部分双链结构(J.Am.Chem.Soc.2009,131,10320–10333；PLoS ONE,2009,4,e5126.)；(2)碱基变异：将原始脱氧核酶中的环(loop)的碱基进行变化(Anal.Chem.2013,85,5430-5435)；(3)化学修饰：将原始脱氧核酶的碱基进行化学修饰(Chem.Commun.,2012,48,8347–8349)。

发明内容