[发明专利]芦荟胶囊在益生菌发酵产品中的应用

权利要求书

1.一种芦荟胶囊在益生菌发酵产品中的应用，其特征是:

（1）芦荟的选择和制备：采选芦荟叶片，剔除带有病斑、软腐的叶片，叶片均重300~400 g；叶片采用75% 酒精进行表面消毒，去除芦荟叶表面皮层，采用榨汁机榨汁，分装后，在离心速度6000 rpm/min下离心10 min，再次分装，制成芦荟原汁；

（2）采用巴氏消毒法将芦荟原汁灭菌，在55 ℃下处理30 min，在4 ℃下保存备用；

（3）植物乳酸杆菌ATCC 8014的活化

A）从-80 ℃冰箱取出植物乳酸杆菌ATCC 8014，接种于5 mL MRS培养基中，在37 ℃下恒温培养箱中培养过夜；

B）取过夜培养的植物乳酸杆菌ATCC 8014，按1%接种5 mL培养基中，二次活化；

（4）发酵：选用二次活化后的植物乳酸杆菌ATCC 8014，按5%接种量添加到芦荟原汁中，并辅以10%脱脂乳和2%葡萄糖，在37 ℃下发酵48h；

A）发酵后处理：发酵完毕，分装发酵液，采用冻干机冻干成粉末状；

B）胶囊的制备：选择海藻酸钠为囊材，以果胶为辅材，胶液总浓度为2％，胶液与菌液体积比为1：1，海藻酸钠与果胶质量比为2：1，CaCL₂浓度为0.3 moL／L；

C）采用制备完成的胶囊包裹冻干后的发酵液粉末，制备芦荟胶囊；

（5）芦荟发酵液抗氧化性指标的测定

 A）DPPH自由基清除能力的测定

 取2ml芦荟发酵液，加入2ml DPPH乙醇溶液，黑暗下室温反应30min，然后用等体积的三氯甲烷抽提，取上清517nm测OD，对照为去离子水加DPPH溶液；

B）羟基自由基清除能力的测定

 取2 mmol/L的硫酸亚铁溶液1 mL, 6 mmol/L过氧化氢1 mL, 6 mmol/L水杨酸1 mL, 并加入芦荟发酵液1 mL，静置 30 min，以蒸馏水为参比，在510 nm处测定吸光度，计算羟自由基的清除率；

     C）3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖；

     a、标准曲线的制作：取8支15 mm×180 mm试管，分别编号为0至7，向其中依次加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.4、1.6、2.0 mL的1 mg/mL的葡萄糖标准溶液，然后用蒸馏水定容到2 mL 再依次加入1.5 mL水杨酸，水浴5 min，取出立即冷却到室温，加21.5 mL蒸馏水，摇匀，在540 nm处测定吸光度；

     b、样品中还原糖含量的测定：以标准曲线制作中0号为对照，向15 mm×180 mm试管中加入1 mL样品溶液,1 mL蒸馏水和1.5 mL水杨酸，水浴5 min，取出立即冷却到室温，加21.5 mL蒸馏水，摇匀，在540 nm处测定吸光度；

c、对Fe²⁺的螯合能力的测定

取0.5 mL芦荟发酵液中加入0.4%的FeSO4溶液0.1 mL混合均匀后，再加入0.1 mL 1%的抗坏血酸溶液和0.2 mol/L氢氧化钠溶液1 mL，37℃下反应20 min，然后用10%的三氯乙酸去除蛋白6000 rpm，10 min，4℃，取0.4 mL上清并加入4 mL 0.1%邻二氮菲，室温反应10 min，测定536 nm处吸光度;

d、总还原力的测定

取1 mL的样品，加入 1 mL的磷酸缓冲液p H=6.6和1%铁氰化钾溶液1 mL，混匀, 在 50 ℃下保温 20 min, 加入 10 %的三氯乙酸溶液1 mL，振荡混匀后取1 mL的混合液, 加入4 mL去离子水和 0.1 %的三氯化铁溶液0.4 mL , 静置10 min，用去离子水为空白, 在700 nm下进行比色，吸光度的值越大，说明还原力越强;

（6）抑菌试验

   A)活化鼠伤寒、肠炎沙门、志贺301、福氏志贺、单增ATCC、金黄色葡萄球菌cowan1、大肠O157、痤疮丙酸杆菌，过夜培养;

B)将8株致病菌的菌体浓度调至10⁸ CFU/mL左右，分别取100 μL菌液涂布于LB平板;

C)待菌液吹干后，在平板中小心放入无菌的牛津杯；将发酵液上清10000 rpm/min离心10 min，向牛津杯中加入发酵液上清;

D)37℃培养6-8 h，每隔2～3 h观察;

E)测量平板中的抑菌圈直径，并照相;

（7）白介素-1β抗炎症因子检测

 A) 收集生长状态较好对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞悬液浓度，接种到六孔板中，每孔加入2mL，铺板使待测细胞调密度105cell/孔，（边缘孔用无菌PBS填充）

  B)在5% CO2，37 ℃培养箱孵育过夜，细胞铺满六孔板底后可加药处理，加LPS(1mg/mL) 2uL培养1h后，加入芦荟大黄素2.5μg/mL, 芦荟大黄素10μg/mL, 芦荟多糖2.5μg/mL, 芦荟多糖15μg/mL, 芦荟原汁5μg/mL, 芦荟原汁50μg/mL, 发酵液5μg/mL, 发酵液50μg/mL, 继续培养12h;

  C) 取各处理组细胞上清进行ELISA检测。