[发明专利]冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法

权利要求书

1.冻干人用狂犬病疫苗，其特征在于，该疫苗是在Vero细胞上接种aG株狂犬病毒，依次经超滤浓缩、分离纯化、冻干后获得的；该疫苗的装量为0.5ml/剂；冻干时所用疫苗冻干保护剂的各成分及其终浓度为：海藻糖60～90g/l、谷氨酸钠6～14g/l、尿素3～6g/l、L-精氨酸2～3g/l、199培养基10g/l，该疫苗冻干保护剂中不含有明胶、人血白蛋白和右旋糖酐。

2.根据权利要求1所述的冻干人用狂犬病疫苗，其特征在于，冻干人用狂犬病疫苗中不含有任何抗生素及防腐剂。

3.制备权利要求1所述的冻干人用狂犬病疫苗的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)毒种采用aG株狂犬病毒，培养基质采用Vero细胞；

(2)将复苏后的Vero细胞采用0.25％胰蛋白酶消化分散均匀，加入199培养液混合均匀后加入到细胞工厂中，置于37℃培养至均匀单层Vero细胞；所述细胞工厂采用美国Nunc或CORNING公司生产的细胞工厂；

(3)采用含10％新生牛血清的199培养液洗换生物反应器内的PBS溶液，生物反应器参数设定：温度37℃，转速50rpm，PH7.0，溶氧50％，待各参数稳定后，接种已消化分散均匀的单层Vero细胞，接种细胞数量即工作体积控制在2×10⁵～5×10⁵个/ml范围内；所述生物反应器采用美国NBS公司生产的14L固定床式BIOFLO CELLIGEN 310型生物反应器；

(4)根据Vero细胞的生长繁殖情况调整生物反应器的灌注量，当Vero细胞密度在2×10⁷～4×10⁷个/ml范围内时，接种aG株狂犬病毒；

(5)弃去生物反应器内细胞培养8～10天的细胞生长液，加入病毒生长液即含3％新生牛血清的199培养液，将工作种子批按0.025～0.125MOI接种于生物反应器内，连续灌注收获病毒液，生物反应器参数设定：温度35℃，转速90rpm，PH7.5，溶氧50％；

(6)接种aG株狂犬病毒后第二天开始采用不含有任何血清成分的199维持液连续收获病毒液，收获20天，取样做无菌检查及病毒滴定试验，置于2～8℃保存；

(7)将同批细胞生产的多次病毒液在无菌条件下合并，采用300KD超滤膜浓缩，浓缩后的病毒液中蛋白含量不超过20mg/ml，若超过该标准则需要进行稀释，再进行无菌检查；

(8)浓缩后的病毒液加入浓度为1:4000的β-丙内酯进行灭活，置于2～8℃连续振摇24小时，2～8℃放置7天使残余的β-丙内酯水解，病毒液灭活后分别取样进行灭活验证试验；

(9)将灭活后的病毒液经4000rpm离心30分钟，吸取上清液，采用柱色谱法进行纯化，色谱介质为琼脂糖凝胶Sepharose 4FF，采用PH7.4、浓度为0.01mol/L且含有0.14mol/L NaCl的PBS溶液洗脱，每次上样量不超过层析柱体积的5％，流速为100～170L/h，280nm紫外监测收集第一峰，起峰后当紫外监测数值升到0.1AU时开始收集，峰回落后当紫外监测数值降至0.1AU时结束收集，然后加入终浓度为1％的人血白蛋白，即获得冻干人用狂犬病疫苗原液，抽样做原液检定后，置于2～8℃保存；

(10)冻干人用狂犬病疫苗原液经检定合格后，根据测定的原液抗原量和蛋白质含量加入疫苗冻干保护剂进行稀释，成为疫苗半成品，然后采用低温真空冷冻干燥法进行分装冻干：导热油温度设定10℃，保持10℃进行疫苗半成品分装，分装结束后，冷冻干燥箱预冷冻至-45～-50℃，使制品温度达到-40℃以下保持至少2个小时，对后箱凝结器预冷至-50℃后，开始抽真空，真空控制设定为8Pa±2Pa，真空报警为18Pa，真空抽至10Pa以下进行第一阶段干燥即升华干燥，导热油温度先设定为-15℃，维持1个小时，然后导热油温度设定为-5℃，维持5个小时，当制品温度上升到导热油出口温度且冻干箱和凝结器的压力接近并维持不变时，在此基础上再维持1小时，以去除制品中的冰晶，然后进入第二阶段干燥即解析干燥，导热油温度设定为45℃，制品温度控制在32～35℃，维持5～7个小时后结束冻干，即制成冻干人用狂犬病疫苗；

所述疫苗冻干保护剂的各成分及其终浓度为：海藻糖60～90g/l、谷氨酸钠6～14g/l、尿素3～6g/l、L-精氨酸2～3g/l、199培养基10g/l，该保护剂中不含有明胶、人血白蛋白和右旋糖酐。