[发明专利]一种大鼠血浆中C4NP的浓度检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种大鼠血浆中C4NP的浓度检测方法，具体地说，涉及一种UPLC-MSMS法检测大鼠血浆中C4NP的浓度。

背景技术

CA4P(Combretastinn A4 phosphate,cis-α-[3,4,5-trimethoxyphenyl]-β-[3-hydroxy-4-metho xyphenyl])是天然产物CA4(combretastatin A4)的前药。CA4是从从非洲丛林柳风车藤属caffrum的树皮中提炼出来的一种杂环植物生物碱，因其可以减低肿瘤血流量而被用作抗癌药物[5-6]。CA4作为一种新型的抗肿瘤血管破坏剂(VDA)，可以区分正常血管和肿瘤血管并选择性破坏异常肿瘤血管，导致血管塌陷。CA4的结构类似于秋水仙碱，能强烈地结合到秋水仙碱结合位点上的微管蛋白，抑制微管组装。组织学研究表明，几个微管蛋白结合剂(如秋水仙碱，鬼臼毒素，长春新碱，和长春碱)，以及其它抗肿瘤剂(例如，肿瘤坏死因子，黄酮乙酸，和相关的化合物)可诱导肿瘤血管损伤，然而，这样的有效作用剂量约达到最大耐受剂量(MTD)，这限制了这些试剂的适用性。与此相反，CA4P在鼠模型中可以小于M TD的十分之一的剂量诱导肿瘤中的血管损伤。CA4P是一种新型的VDA抗肿瘤剂并且是第一个进入临床的考布他汀类似物药物。CA4P已经被批准用于治疗甲状腺癌、卵巢癌，食道癌，小细胞肺癌和黑色素瘤。CA4P目前正在临床试验中(第三阶段)，以评估其与紫杉醇或卡铂的组合是否能够提高针对未分化甲状腺癌的安全性和有效性。

C4NP是一种在CA4P的结构基础上改进的新的考布他汀类似物，在水溶液中稳定。C4NP有望成为一种新型的抗癌药物。因此，其药代动力学研究对其进入临床应用是非常重要的。传统的用于定量的方法如高效液相色谱(HPLC)不满足较短的运行时间和高灵敏度的要求。近年来，超高效液相色谱(UPLC)取得显著的进步，不仅加快了分析速度，还大大的提高了峰值分辨率。超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)具有相对短的分析时间和敏感高等特点，已被用作药动学研究的新型工具。

这项研究的目的是建立一种快速、灵敏的UPLC-MS/MS方法检测C4NP在SD大鼠血浆的浓度及其药代动力学研究。整个过程是在美国食品药品管理局生物分析方法验证的指导方针下进行。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提出了一种大鼠血浆中C4NP的浓度检测方法。其技术方案如下：

一种大鼠血浆中C4NP的浓度检测方法，包括以下步骤：

1)配置浓度约为10μg/mL的C4NP溶液，进行质谱条件优化；

2)C4NP进行色谱条件优化以确定色谱柱、流动相组成及比例等条件；

3)根据C4NP的结构、理化性质等条件选择并优化C4NP样品前处理方法；

4)建立C4NP的UPLC-MS/MS方法并进行方法学验证，验证内容包括方法学专属性、线性、准确度与精密度、提取回收率与基质效应、稳定性、稀释效应。

进一步优选，C4NP进行质谱条件优化，离子源为ESI源；正离子SRM工作模式；喷雾电压：3500V；毛细管温度：300℃；鞘气：45arb；辅助气：5arb；C4NP的离子对m/z:407→327；丁螺环酮离子对m/z:386→122，用作内标。进行色谱条件优化，色谱柱：Kinetex C18XB，流动相：水-乙腈，流速：0.3mL/min；进样量：10μL。C4NP的样品前处理方法采用简单的蛋白沉淀法。将–80℃冷冻保存的血浆样品90μL解冻，加入100 ng/mL内标IS溶液10μL，涡旋混匀，加入400μL甲醇，2000频率振荡10min。12000r/min，4℃离心10min，后吸取上清液400μL，35℃下氮气吹干，用100μL10％乙腈水溶液复溶，2000频率振荡10min。12000r/min，4℃离心10min，取10μL上清液，UPLC-MS/MS进样分析。方法学验证表明：在本实验条件下，C4NP和内标丁螺环酮均有较大的色谱峰，相互之间没有明显的干扰，大鼠空白血浆中杂质不干扰样品峰。该方法专属性较高。标准曲线：Y＝-0.018641+0.0264371X，r＝0.9996，线性关系良好，定量下限为5.703ng/mL，日内和日间精密度均＜15.00％，准确度在85.00-115.00％之间；低、中、高3个QC浓度中C4NP的提取回收率在72.86％～77.86％之间，RSD均在15.00％以内，C4NP血浆样品在4℃、25℃中保存12h后稳定，经3次反复冻融后不受影响。