[发明专利]一种海参组织蛋白酶的原核表达方法

权利要求书

1.一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，其特征是：包括对海参组织蛋白酶基因序列克隆；在获得海参组织蛋白酶基因序列克隆的基础上构建具有所述的海参组织蛋白酶基因序列的融合表达载体，然后将所述的融合表达载体转化到表达宿主菌进行诱导表达目标蛋白；所述的海参组织蛋白酶基因序列含有SEQ1序列。

2.根据权利要求1所述的一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，其特征是：所述的表达宿主菌为大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，其特征是：所述的海参组织蛋白酶基因序列克隆所使用的扩增目标蛋白DNA片段的引物为增加EcoRI和NotI识别位点的

引物1：F:5’-CCGGAATTCATGCCAGACACTGTTGATT-3’；

引物2：R:5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGACAGTTGGGTAACTG-3’。

4.根据权利要求1所述的一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，其特征是：构建所述的融合表达载体所使用的限制性内切酶为EcoRI和NotI，双酶切所获得的DNA序列片段长度约660bp，通过DNA连接酶作用，连接至pET32a，完成表达载体构建。

5.根据权利要求1所述的一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，其特征是：所述的宿主菌的诱导表达步骤如下：将构建完成的融合表达质粒转化到大肠杆菌，利用IPTG进行诱导表达目标蛋白。

6.根据权利要求1所述的一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，其特征是：所述的融合表达载体选自pET32a载体。

7.根据权利要求5所述的一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，其特征是：所述的IPTG诱导表达组织蛋白酶的温度低于30℃，IPTG浓度小于3mM，诱导表达的组织蛋白酶以非包涵体形式表达于大肠杆菌胞内。

8.根据权利要求6所述的一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，其特征是：所述的pET32a载体的构建步骤如下：以添加限制性内切酶识别位点序列的引物，克隆制备海参组织蛋白酶成熟肽区域基因序列，使用内切酶，对PCR产物以及空载pET32a载体分别进行双酶切，通过电泳及胶回收纯化酶切产物，混合经过双酶切处理的组织蛋白酶基因片段及载体片段，使用DNA快速连接酶连接构建表达载体。