[发明专利]一种海参组织蛋白酶的原核表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种海参组织蛋白酶的原核表达方法。

背景技术

原胶蛋白是机体组织的结构蛋白，其诸多生理功能已被系统研究和广泛认可。随着胶原蛋白产业的快速发展，胶原蛋白酶解工艺中的关键生产要素—蛋白酶的需求也不断增长。目前较为常用的各类酶普遍存在胶原蛋白酶解效率不高的缺点，而运用基因工程技术开发新型胶原蛋白酶可以弥补这一致命缺陷，且采用生物工程技术生产的胶原蛋白酶产品品质易控、生产成本低廉。刺参具有极强的自溶能力究其本质即是组织细胞内蛋白酶对体壁组织蛋白（主要为胶原蛋白）的高效酶解作用。然而，有关刺参组织蛋白酶基因的筛选、功能研究及相关蛋白酶产品开发却尚未系统开展。本发明针对现有技术的不足，提供一种海参组织蛋白酶的原核表达方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术提供一种采用大肠杆菌低成本表达海参组织蛋白酶、表达产物品质容易控制的一种海参组织蛋白酶的原核表达方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，包括，其中：包括对海参组织蛋白酶基因序列克隆；在获得海参组织蛋白酶基因序列克隆的基础上构建具有海参组织蛋白酶基因序列的融合表达载体，然后将融合表达载体转化到表达宿主菌进行诱导表达目标蛋白；海参组织蛋白酶基因序列含有SEQ1序列。

为优化上述技术方案，采取的措施还包括：表达宿主菌为大肠杆菌。海参组织蛋白酶基因序列克隆所使用的扩增目标蛋白DNA片段的引物为增加EcoRI和NotI识别位点的

引物1：F:5’-CCGGAATTCATGCCAGACACTGTTGATT-3’；（SEQ3）

引物2：R:5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGACAGTTGGGTAACTG-3’。（SEQ4）

构建融合表达载体所使用的限制性内切酶为EcoRI和NotI，双酶切所获得的DNA序列片段长度约660bp，通过DNA连接酶作用，连接至pET32a，完成表达载体构建。宿主菌的诱导表达步骤如下：将构建完成的融合表达质粒转化到大肠杆菌，利用IPTG进行诱导表达目标蛋白。融合表达载体选自pET32a载体。pET32a载体的构建步骤如下：以添加限制性内切酶识别位点序列的引物，克隆制备海参组织蛋白酶成熟肽区域基因序列。使用内切酶，对PCR产物以及空载pET32a载体分别进行双酶切，通过电泳及胶回收纯化酶切产物。混合经过双酶切处理的组织蛋白酶基因片段及载体片段，使用DNA快速连接酶连接构建表达载体。IPTG诱导表达组织蛋白酶的温度低于30℃，IPTG浓度小于3mM，诱导表达的组织蛋白酶以非包涵体形式表达于大肠杆菌胞内。

本方法步骤如下：

1）预测蛋白结构分析

查找确定刺参组织蛋白酶基因全长序列的开放阅读框，确定编码序列并推测编码蛋白的氨基酸序列，采用生物信息学的方法进行蛋白质结构功能域分析并确定基因编码蛋白结构特征，明确结构域位置和所需表达的蛋白序列。

2）pET32a融合表达载体构建

以添加限制性内切酶识别位点序列的引物，克隆制备海参组织蛋白酶成熟肽区域基因序列。使用内切酶，对PCR产物以及空载pET32a载体分别进行双酶切，通过电泳及胶回收纯化酶切产物。混合经过双酶切处理的组织蛋白酶基因片段及载体片段，使用DNA快速连接酶连接构建表达载体。

3）大肠杆菌原核表达

将构建完成的融合表达质粒转化到表达宿主菌—BL21（DE3）大肠杆菌，利用IPTG进行诱导表达目标蛋白。通过诱导表达温度及时间双因素分析，优化组织蛋白酶原核表达的培养条件及诱导效果。

所述步骤1）中，使用NCBI网站BLASTX软件进行基因保守域分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，使用ClustalW2对预测氨基酸序列进行特征分析(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)，利用signalP4.1在线软件，分析序列蛋白信号肽区域特征(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，利用PROSITE在线软件分析活性功能位点及结构域(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)，采用PDBSUM数据库预测分析蛋白二级结构、二硫键、配体结合位点等结构信息，PROCAT数据库预测分析活性位点三维结构，NRL-3D数据库相似蛋白结构分析。通过软件分析，明确具有蛋白酶解功能的目标序列，确定扩增序列所使用的引物序列。