[发明专利]基于标记基因的真菌遗传筛选方法

说明书

本发明公开一种基于筛选标记基因的真菌遗传转化方法，其包括对受体真菌HOG1 MAPK信号途径关键基因的克隆，受体真菌HOG1 MAPK信号途径关键基因敲除载体的构建，受体真菌HOG1 MAPK信号途径关键基因敲除突变体的获得，受体真菌HOG1 MAPK信号途径关键基因敲除突变体耐渗透性和耐盐性测定，受体真菌HOG1 MAPK信号途径关键基因作为筛选标记，转化验证。通过本发明的方法丰富了真菌遗传转化筛选标记的来源，当受体菌无多个筛选标记时，可满足研究者开展双基因或多基因功能研究的需要。

技术领域

本发明涉及微生物遗传转化工程领域。具体地，本发明涉及一种基于筛选标记基因的真菌遗传筛选方法。

背景技术

真菌广泛分布于自然界，与人类的生产生活关系密切，在农业、工业、医药、保健卫生以及科学研究中具有重要的作用。DNA遗传转化是人们进行菌种改良、有用基因克隆和基因功能研究的重要途径。自1973年Mishra和Tatum首次报道粗糙脉孢霉成功转化DNA以来，丝状真菌遗传转化研究进展非常迅速。目前丝状真菌转化方法主要包括以下几种：(1)CaCl2-PEG介导的原生质体转化；(2)电穿孔转化；(3)基因枪转化；(4)限制性内切酶介导的遗传转化；(5)农杆菌介导的遗传转化；(6)转座子介导转化；等等。这些遗传转化方法建立的重要前提是需要有有效的筛选标记。

目前选择标记主要有以下几个类型：药物抗性、营养缺陷型、突变体表型。近年来，随着分子生物学的研究发展，可供选择的筛选标记越来越多。但与细菌及酵母菌相比，丝状真菌的遗传、形态等较为复杂，遗传体系发展也相对缓慢。发展受限的主要原因在于丝状真菌筛选标记基因数量有限或已知的筛选标记基因使用范围受限。如营养缺陷标记和突变体表型标记受到转化受体菌株或者特异突变表型的限制，应用范围有限；有些丝状真菌对常用的潮霉素和新霉素等药物表现不敏感，无法有效区分转化子和野生型；一种真菌可选择的筛选标记数量有限，无法对双基因或多基因进行转化研究。因此，不断的寻找更多新的能作为遗传转化的筛选标记，可有效促进真菌的遗传转化发展。

MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase，促分裂原活化蛋白激酶)也称细胞外信号调节激酶，是一组在进化上高度保守的蛋白激酶，广泛存在于各种生物诸如哺乳动物、植物，酵母和真菌中，它们在生物体内的多种细胞信号转导途径中占有非常重要的地位，参与介导细胞生长、分裂、分化、死亡以及细胞间的功能同步等多种生理过程。HOG1MAPK信号途径(即高渗甘油应答途径，The high osmolarity glycerol pathway)是MAPK信号途径之一，主要由MAPK(HOG1p)、MAPKK(PBS2p)、和MAPKKK(STE11p，SSK2p和SSK22p)组成。HOG1MAPK信号途径在诱导胁迫反应基因的表达、细胞形态恢复、信息素反应途径的阻遏及其致病性等方面都起重要作用。根据现有研究报道，该信号途径受到外界高渗条件的诱导，激活甘油合成相关酶基因的转录，使胞内产生积累高浓度甘油而维持胞内较高的膨压，从而具有高渗透压、耐盐胁迫等功能。真菌缺失HOG1 MAPKA途径关键基因(如HOG1基因、PBS2基因等)是菌株在高渗培养基和高盐培养基中表型极为敏感。目前为止，未见通过该类基因这一特性作为真菌遗传转化筛选的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对目前真菌筛选标记基因数量有限或已知的筛选标记基因使用范围受限，无法对双基因或多基因进行转化研究，本发明建立一种利用真菌HOG1 MAPK信号途径关键基因作为真菌筛选标记基因的方法。

本发明解决这一技术问题所采用的技术方案是，提供一种真菌遗传筛选方法，其包括：

克隆受体真菌HOG1 MAPK信号途径关键基因，所述HOG1 MAPK信号途径为高渗甘油应答途径，由MAPK、MAPKK和MAPKKK组成；

构建受体真菌HOG1 MAPK信号途径关键基因敲除载体；

获得受体真菌HOG1 MAPK信号途径关键基因敲除突变体；