[发明专利]一种附甘药物质量检测方法

权利要求书

1.一种附甘药物质量检测方法，其特征在于：采用高效液相色谱法鉴别附子，采用薄层色谱法鉴别甘草，采用高效液相色谱法控制双酯型生物碱，采用高效液相色谱法测定附子与甘草含量。

2.根据权利要求1的一种附甘药物质量检测方法，其特征在于：

【性状】  本品内容物为棕黄色至棕褐色，味微甜、微苦；

【鉴别】  (1)附子鉴别：照附子含量测定项下的方法试验，供试品色谱中应呈现与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱对照品色谱峰保留时间相对应的色谱峰，即确定是含有附子的制剂；

(2) 甘草鉴别：取本品内容物0.5~2.5g，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材1g，同法制成对照药材溶液；再取甘草苷对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以正丁醇﹕浓氨试液﹕乙醇=5﹕2﹕1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，即确定是含有甘草的制剂；

【检查】双酯型生物碱：照《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ D高效液相色谱法测定；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈﹕四氢呋喃=25﹕15为流动相A，以含0.03mol/L磷酸二氢钾的0.1%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为232nm；理论板数按乌头碱峰计算应不低于30000；

表1  梯度洗脱程序

对照品溶液的制备 取新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品贮备液各5ml，置50ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得；

固相萃取柱系统适用性试验 精密量取对照品贮备液各3ml，混匀，室温减压回收至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液50ml使溶解，精密量取5ml，置于处理好的固相萃取柱上，固相萃取柱以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱；依次以0.lmol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈﹕浓氨试液=90﹕10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈﹕0.1%磷酸溶液=30﹕70的混合溶液3ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；

分别精密吸取上述固相萃取柱系统适用性试验溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液和对照品溶液各相应成分峰面积比值，不得小于0.95；

供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取1~3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙腈﹕浓氨试液=90﹕10的混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，用乙腈﹕浓氨试液=90﹕10的混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取25ml续滤液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，滤过，滤液照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱上”起，依法操作，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

其他 应符合《中国药典》2010年版一部附录制剂通则项下有关的各项规定；

【含量测定】附子含量测定：照《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ D高效液相色谱法测定；

色谱条件与系统适用性试验：以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈﹕0.1%的磷酸溶液=23﹕77为流动相；检测波长为232nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算不低于5000；

对照品溶液的制备  取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含 0.2mg的溶液，作为对照品贮备液；分别精密量取上述对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，置同一100ml的量瓶中，用0.1%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液，分别精密量取各对照品贮备液15ml、2ml、3ml，置同一200ml的量瓶中，加乙腈至40ml，用0.1%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml含苯甲酰新乌头原碱15μg、苯甲酰乌头原碱2μg、苯甲酰次乌头原碱3μg的对照品溶液；

固相萃取柱系统适用性试验  精密量取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，混匀，室温减压回收至干，用0.1mol/L盐酸溶液适量溶解并定容至200ml，精密量取10ml，置于处理好的固相萃取柱上，此固相萃取柱以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，规格为150mg、6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱；依次以水3ml，1.25%的氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈﹕浓氨试液=90﹕10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加入流动相5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；

分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，均不小于0.95；

供试品溶液的制备  取附甘颗粒，研细，称取0.2~0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理40分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，以每分钟4000转离心30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱”起，依法操作，即得；

测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

甘草含量测定：照《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ D高效液相色谱法测定；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈﹕0.5％冰醋酸溶液=18﹕82为流动相；检测波长为276nm；理论板数按甘草苷峰计算应不低于4000；

对照品溶液的制备：取甘草苷对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成每1ml含20μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本品内容物，研细，取 0.2~0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。