[发明专利]一种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的方法及使用的引物和试剂盒

权利要求书

1.一种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的方法，其特征是：PCR扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的基因序列， 选择PID1基因第2外显子的第285位碱基为G的布莱凯特黑牛为优质牛种；包括以下步骤：

（1）取布莱凯特黑牛待检样本，提取DNA，作为PCR扩增的模板DNA；

（2）采用PCR扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子，得PCR产物，扩增所用的引物如下：

上游引物：5’GTGACCTATCTGGGTAAGGTGCCC3’

下游引物：5’TCAGCCATCATCAGATTCTAATTCCTGGG3’；

（3）利用限制性内切酶酶切扩增的PCR产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择琼脂糖凝胶电泳产生1个片段的布莱凯特黑牛为优质牛种；所述限制性内切酶为限制性内切酶 AseⅠ。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是： PCR反应条件为：94℃预变性7min、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环，最后72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是： PCR反应体系为：模板DNA2.0μL，含Mg²⁺的10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP 4.0 μL，扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的上、下游引物各1.0μL，5U/μL 的Taq酶0.3 μL，加双蒸水至总体积为50.0 μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：用限制性内切酶进行酶切时，酶切体系如下：10U/μL的限制性内切酶0.5 μL，10×NEBuffer 3.1 2 μL，PCR产物10 μL，加双蒸水至总体积为20.0 μL。

5.一种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的试剂盒，其特征是：包括单独包装的扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的引物，以及限制性内切酶AseⅠ；所述扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的引物如下：

上游引物：5’GTGACCTATCTGGGTAAGGTGCCC3’

下游引物：5’TCAGCCATCATCAGATTCTAATTCCTGGG3’。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征是：还包括单独包装的含Mg²⁺的10×PCRBuffer、dNTP、Taq酶和10×NEBuffer 3.1。

7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征是，包括以下成分，各成分均单独包装：

扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的上游引物：1.0μL；

扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的下游引物：1.0μL；

含Mg²⁺的10×PCR Buffer：5.0 μL；

dNTP：4.0 μL；

5U/μL 的Taq酶：0.3 μL；

10U/μL的限制性内切酶AseⅠ：0.5μL；

10×NEBuffer 3.1：2 μL。