[发明专利]一种基于多探针富集56基因靶区域的方法

权利要求书

1.一种基于多探针富集56基因靶区域的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1gDNA片段化和加接头adaptor

1.1)准备所需试剂如下：

SureSelect QXT终止反应液、SureSelect QXT缓冲液、SureSelect QXT转座酶溶液、二甲基亚砜(DMSO)、AMPure XP磁珠、乙醇；

1.2)定量待建库样本，调整浓度至25ng/μL，体积2μL；

1.3)PCR仪设置DNA片段化程序，设好程序后，点击开启，再立即点击暂停；

1.4)SureSelect QXT缓冲液和SureSelect QXT转座酶溶液分别高速涡旋混匀备用；

1.5)将SureSelect QXT缓冲液、样本和SureSelect QXT转座酶溶液依次添加到PCR管中，于冰上操作配制片段化反应体系，每种试剂单独添加；配制完成后，短暂离心，再高速涡旋充分混匀20s，并再次短暂离心，完成后立即将PCR管放置于步骤1.3)中暂停的PCR仪上，重新启动反应程序；

1.6)PCR完成后，立即将其转移至冰上；然后往其中加32μL1×SureSelect QXT终止反应液，高速涡旋5s，短暂离心，室温孵育1min；

S2AMPure XP磁珠纯化

2.1)将AMPure XP磁珠在使用前充分混匀并平衡至室温；

2.2)将步骤S1中得到的已片段化和加接头adaptor的样本转移至新的1.5mL EP管中；

2.3)加入52μL充分混匀的AMPure XP磁珠，涡旋5s，短暂离心，保证磁珠没有沉底；

2.4)置于混匀仪上室温孵育5min；

2.5)孵育好的样本短暂离心，放磁力架上吸附磁珠，时间为3-5min，弃上清；

2.6)加300μL现配的70％乙醇，计时1min，期间沿水平方向缓慢旋转EP管一圈，令干扰的磁珠下沉，弃上清；

2.7)重复步骤2.6)一次；

2.8)短暂离心，将EP管重新放回磁力架静置30s，使用P10移液器除净残留乙醇；

2.9)37℃烘干磁珠，时间为1-3min，或置于通风厨1-3min使磁珠干燥；干燥完成后，加36μL不含核酸酶的水，涡旋混匀，短暂离心；

2.10)室温孵育2min，放置磁力架上，取一定量上清至新的PCR管中，即得到纯化样本并放置冰上；

S3捕获前PCR

3.1)所需试剂如下：

Herculase II Fusion DNA聚合酶、5×Herculase II反应缓冲液、每个三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)25mM的100mM dNTP混合液、SureSelect QXT引物混合物、DMSO、AMPure XP磁珠和乙醇；

3.2)在冰上操作，将5×Herculase II反应缓冲液、每个dNTP25mM的100mM dNTP混合液、DMSO、SureSelect QXT引物混合物、Herculase II Fusion DNA聚合酶配制捕获前PCR反应混合液，一次反应中各试剂的剂量依次为10μL、0.5μL、2.5μL、1μL、1μL和15μL；

3.3)将步骤3.2)中制得的捕获前PCR反应混合液加入35μL步骤S2中得到的纯化样本中，涡旋5s混匀；然后放置于PCR仪上，设置PCR反应程序并启动；反应完毕后得到捕获前PCR样本并放置冰上；

S4AMPure XP磁珠纯化

4.1)将XP磁珠在使用前充分混匀并平衡至室温；

4.2)将步骤S3得到捕获前PCR样本转移至新的1.5mL EP管中；

4.3)按照步骤2.3)-2.10)进行操作；完成后即得到预文库；

S5将步骤S4得到预文库进行质量检测和浓度检测，包括预文库DNA的片段大小是否主要分布在245-325bp、以及DNA浓度是否满足≥500ng；

S6预文库DNA的准备

6.1)取一定量的通过步骤S5检测的预文库至新PCR管中；

6.2)将步骤6.1)中的样本PCR管放入浓缩仪中进行浓缩蒸干；

6.3)加入12μL不含核酸酶的水进行溶解，得到12μL预文库DNA；

S7杂交

7.1)准备所需试剂如下：

SureSelect QXT快速杂交缓冲液、SureSelect QXT快速封闭液、SureSelect RNase封闭剂、捕获探针库；

7.2)分两管配制混合液，记为A管和B管，A管中，用12μL步骤S6得到的预文库DNA和5μL的SureSelect QXT快速封闭液配制混合液，用移液器上下吹打8-10次，涡旋5s混匀，短暂离心；B管中配制捕获库杂交混合液，涡旋5s混匀，放置室温备用；

7.3)PCR仪上设置反应程序，体积设置为30μL；

7.4)将A管转移至PCR仪上，启动运行，在运行一段时间暂停运行；

7.5)在PCR仪上，将B管中的捕获库杂交混合液转移至A管中，用移液器上下吹打8-10次，然后密封好，涡旋5s，快速离心后放回PCR仪上继续杂交反应程序，反应完毕后得到杂交样本；

S8T1磁珠捕获

8.1)准备所需试剂如下：

SureSelect结合缓冲液、SureSelect洗液2、SureSelect洗液1、Dynabeads MyOne链霉素T1磁珠；

8.2)将Dynabeads MyOne链霉素T1磁珠涡旋混匀后，取50μL至新的1.5mL EP管中，置于磁力架上静置几分钟，待澄清后弃上清；

8.3)向步骤8.2)已加入T1磁珠的EP管中加入200μL SureSelect结合缓冲液，移液器上下吹打10次，放置于磁力架上静置，待澄清后弃上清；

8.4)重复步骤8.3)两次；

8.5)向完成步骤8.4)后的EP管中加入200μL SureSelect结合缓冲液重悬磁珠备用；

8.6)将步骤S7最终得到的杂交样本转移至室温，在室温下将30μL杂交样本转移至步骤8.5)已加入200μL SureSelect结合缓冲液的EP管中，以1800rmp的速度混匀，在混匀仪上室温孵育30min；

8.7)按照600μl/样本的量预热SureSelect洗液2，保证步骤8.10)使用时温度达65℃；

8.8)步骤8.6)孵育好的样本短暂离心后放磁力架上，待澄清，弃上清，然后加入200μL SureSelect洗液1，吹打8-10次，确保磁珠悬浮；

8.9)高速涡旋8s，短暂离心，放置于磁力架上静置，待澄清后弃上清；

8.10)加200μL步骤8.7)中预热的SureSelect洗液2，移液器上下吹打至少10次确保磁珠重悬；然后高速涡旋5s，短暂离心；离心完成后，在65℃下孵育10min；孵育完成后，放置于磁力架上静置，待澄清后弃上清；重复上述操作两次；

8.11)快速离心，放置于磁力架上静置，吸干残留液体；然后加入23μL不含核酸酶的水，混匀，得到23μL带T1磁珠的样本，放置冰上备用；

S9捕获后PCR加标签Index：

9.1)实验前试剂准备，所需试剂如下：

Herculase II Fusion DNA聚合酶、5×Herculase II反应缓冲液、每个dNTP 25mM的100mM dNTP混合液、SureSelect QXT P7和P5双端标签引物、AMPure XP磁珠、乙醇；

9.2)在冰上配制捕获后PCR反应混合液，一次反应的配制剂量为不含核酸酶的水13.5μL、5×Herculaes II反应缓冲液10μL、每个dNTP 25mM的100mM dNTP混合液0.5μL、Herculase II Fusion DNA聚合酶1μL；涡旋混匀；

9.3)将捕获后PCR反应混合液加入步骤S8最终得到的23μL带有T1磁珠的样本EP管中；

9.4)依次加入1μL P7端接头引物和1μL P5端接头引物，上下吹打混匀，确保磁珠重悬；然后进行PCR仪反应设置；

9.5)将PCR后的样本管放置磁力架上，取50μL上清至新的1.5mL EP管中；

S10AMPure XP磁珠纯化

10.1)使用前充分混匀XP磁珠；

10.2)加60μL充分混匀的XP磁珠至上述转移至1.5mL EP管中的样本中，涡旋5s，短暂离心，保证磁珠没有沉底；

10.3)置于混匀仪上室温孵育5min；

10.4)放磁力架上吸附磁珠3-5min，弃上清；

10.5)加300μL现配的70％乙醇，计时1min，期间沿水平方向缓慢旋转EP管一圈，令干扰的磁珠下沉，弃上清；

10.6)重复步骤10.5)一次；

10.7)短暂离心，将EP管重新放回磁力架静置30s，使用P10移液器除净残留乙醇；

10.8)37℃烘干磁珠，时间为1-3min，或置于通风厨1-3min使磁珠干燥；

10.9)加25μL不含核酸酶的水，涡旋混匀，短暂离心；然后室温孵育2min，放置磁力架上，取25μL上清至新的1.5mL管中，即得到文库，放置冰上；

S11对步骤S10得到的文库进行质量检测以及qPCR检测。