[发明专利]一种基于多探针富集56基因靶区域的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于多探针富集56基因靶区域的方法。

背景技术

在过去的数年里，对NSCLC(非小细胞肺癌)的生物学认知取得进步促使可以识别出对于恶性肿瘤转化和癌细胞生存至关重要的一些分子事件并形成了潜在治疗靶点。近年来，关于针对非小细胞肺癌的靶向治疗药物进展迅速，已获FDA批准的有EGFR小分子抑制剂吉非替尼，厄洛替尼，ALK小分子抑制剂克唑替尼，色瑞替尼等。值得注意的是，这些靶向治疗药物都只针对携带某些特定基因变异的人群有效。如携带EGFR L858R或19号外显子缺失性突变的非小细胞肺癌患者对第一代EGFR小分子抑制剂敏感。而携带ALK融合的非小细胞肺癌患者则对ALK小分子抑制剂敏感。因此，随着靶向治疗药物的推广，与之配合的伴随分子诊断变得必不可少。2015年美国癌症联盟(NCCN)指南中建议对非小细胞肺癌患者检测七项与靶向药物相关的基因变异：EGFR突变，ALK融合，MET扩增，ERBB2突变，BRAF突变，ROS1突变，以及RET突变。

早期分子诊断采用多种技术平台，如定量PCR，FISH，免疫组化等，一次检测一种或几种基因变异，对同一患者采用顺位检测的方法。传统方法的局限性在于，由于每次检测仅限于一种基因，所需的活检组织量随检测基因数的增长而增加。在可预见的未来，将难以满足检测所有靶标基因的需求。与此同时，近期有研究表明，肺癌中的重要靶点基因变异并非完全互斥，而是在一小部分患者中并存。Wu et al.的研究显示，中国非小细胞肺癌患者中有1.3％同时携带EGFR突变与ALK融合(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24443562)。对于这些患者，对于分子靶点基因变异顺序检测的方法会引起某些基因变异事件的漏检，从而使医生对该患者最适宜的靶向治疗方法产生可能的误判。而基于目标区域捕获的DNA二代测序法可以一次性平行检测几十，乃至上百种基因中包括点突变，插入缺失，DNA拷贝数改变，融合重排等多种变异形式，从而一次性检出所有与靶向治疗相关的靶点基因变异，并对于同时并存的基因变异的突变丰度进行估算与排序。因此为突破传统分子诊断方法的局限提供了新的途径。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种多探针富集56基因靶区域的方法，通过设计专用的捕获探针库，采用探针捕获技术一次性富集多个基因多靶点序列，从而实现多基因多靶点并行深度高通量测序。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于多探针富集56基因靶区域的方法，包括如下步骤：

S1 gDNA片段化和加接头adaptor

1.1)准备所需试剂如下：

SureSelect QXT终止反应液、SureSelect QXT缓冲液、SureSelect QXT转座酶溶液、二甲基亚砜(DMSO)、AMPure XP磁珠、乙醇；

1.2)定量待建库样本，调整浓度至25ng/μL，体积2μL；

1.3)PCR仪设置DNA片段化程序，设好程序后，点击开启，再立即点击暂停；

1.4)SureSelect QXT缓冲液和SureSelect QXT转座酶溶液分别高速涡旋混匀备用；

1.5)将SureSelect QXT缓冲液、样本和SureSelect QXT转座酶溶液依次添加到PCR管中，于冰上操作配制片段化反应体系，每种试剂单独添加；配制完成后，短暂离心，再高速涡旋充分混匀20s，并再次短暂离心，完成后立即将PCR管放置于步骤1.3)中暂停的PCR仪上，重新启动反应程序；

1.6)PCR完成后，立即将其转移至冰上；然后往其中加32μL1XSureSelect QXT终止反应液，高速涡旋5s，短暂离心，室温孵育1min；

S2 AMPure XP磁珠纯化

2.1)将AMPure XP磁珠在使用前充分混匀并平衡至室温；

2.2)将步骤S1中得到的已片段化和加接头adaptor的样本转移至新的1.5mL EP管中；

2.3)加入52μL充分混匀的AMPure XP磁珠，涡旋5s，短暂离心，保证磁珠没有沉底；

2.4)置于混匀仪上室温孵育5min；

2.5)孵育好的样本短暂离心，放磁力架上吸附磁珠，时间为3-5min，弃上清；

2.6)加300μL现配的70％乙醇，计时1min，期间沿水平方向缓慢旋转EP管一圈，令干扰的磁珠下沉，弃上清；

2.7)重复步骤2.6)一次；