[发明专利]猪圆环病毒2型基因工程亚单位口服疫苗的制备方法

说明书

本发明涉及猪圆环病毒2型基因工程亚单位口服疫苗的制备方法，包括以下步骤：1、序列合成；2、重组载体在大肠杆菌中的构建；3、重组载体在乳酸乳球菌MG1363中的构建；4、蛋白的表达，重组菌保存实验以及疫苗的制备。本发明具有以下有益效果：不需要对抗原进行特殊处理，避免了抗原纯化，减少抗原损失；优化基因序列，提高了抗原表达量；优化表达条件，解决了其他原核表达添加诱导剂对动物存在毒性问题以及高成本问题，并且避免了在表达过程中添加诱导剂增加污染几率和加大工作量；采用本发明的方法，成本低，效果显著；本发明采用口服疫苗，避免了常规注射疫苗所引起的应激及疫苗吸收问题。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及猪圆环病毒2型基因工程亚单位口服疫苗的制备方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(PCV2)不仅可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，而且也与猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪先天性振颤、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等疾病密切相关。自从19世纪90年代发现可致猪的疾病以来，PCV2病毒在世界各国迅速蔓延。目前PCV2在猪群中的感染率非常高，造成猪的生长缓慢，饲料报酬下降，同时侵害猪的免疫系统，导致猪的免疫机能下降，造成其它疾病的大暴发。我国也于2000年检测到了该病毒的存在，该病毒在我国猪群的感染率近乎50％。目前对于该病毒的防制主要是依靠疫苗，而由于该病毒在细胞上增殖滴度很低，发展传统的灭活疫苗和弱毒疫苗非常困难，因此，研制安全、高效、廉价的新型疫苗成为越来越多研究者关注的焦点，但目前的试验性疫苗诱发的免疫原性均不够理想，使得对于PCV2的新型疫苗的研究进展一直比较缓慢。

构建重组杆状病毒毒株rBac/PCV2ORF2可在昆虫细胞中高效表达重组PCV2-ORF2蛋白，所表达的重组ORF2蛋白具有良好的免疫活性和抗原性，可作为预防圆环病毒2型感染引起的相关疫病用亚单位疫苗。但是该方法需要对蛋白进行纯化，然后加入灭活剂、防腐剂等试剂乳化制苗并进行注射免疫，制备疫苗的过程繁琐，工艺复杂，作为常规注射疫苗，容易引起应激及疫苗吸收问题。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提供猪圆环病毒2型基因工程亚单位口服疫苗的制备方法，以解决上述提到的问题。

本发明提出了猪圆环病毒2型基因工程亚单位口服疫苗的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、将猪圆环病毒2型ORF2基因进行优化改造，并且对所述ORF2基因序列进行合成，得到pUC18-ORF2质粒；

步骤2、对所述pUC18-ORF2质粒在大肠杆菌中构建pMG36e–ORF2质粒，并进行测序分析；

步骤3、将所述pMG36e–ORF2质粒在乳酸乳球菌MG1363中构建，得到乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-ORF2 CCTCC2015156；

步骤4、所述乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-ORF2 CCTCC2015156接种到GM17液体培养基中培养为菌液，28℃静置培养8-10h，将所述菌液按5％接种到GM17液体培养基中，28℃静置培养约12-16h后离心收集菌体，在所述静置培养期间每隔4-6h、180-220r/min振荡培养10min；用灭菌PBS洗涤细胞1次，离心收集菌体，最后加入生理盐水与含一定比例蔗糖和脱脂牛奶的混合液按1：1体积混合均匀，制备疫苗。

与现有技术相比，本发明提供的猪圆环病毒2型基因工程亚单位口服疫苗的制备方法具有以下有益效果：

1、本发明猪圆环病毒2型基因工程亚单位口服疫苗的制备方法不需要对抗原进行特殊处理，避免了抗原纯化，减少抗原损失；

2、优化基因序列，提高了抗原表达量；

3、优化蛋白表达条件，解决了其他原核表达添加诱导剂对动物存在毒性问题以及高成本问题，并且避免了在表达过程中添加诱导剂增加污染几率和加大工作量；