[发明专利]用于检测甜菜霜霉病菌的引物探针序列及检测试剂盒

说明书

本发明公开了用于检测甜菜霜霉病菌的引物探针序列及检测试剂盒。本发明提供了用于检测或辅助检测甜菜霜霉病菌的试剂盒，包括由序列表中序列1所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子组成的引物对。本发明的实验证明，本发明根据甜菜霜霉病菌与其近似种28S rDNA序列的差异设计特异引物和TaqMan‑MGB探针，将荧光定量PCR技术应用于甜菜霜霉病菌检测，以期获得一种灵敏、准确、简便和快速的检测方法，对进出口货物及产品检验检疫、病害防治预测具有指导意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及用于检测甜菜霜霉病菌的引物探针序列及检测试剂盒。

背景技术

甜菜霜霉病菌(Peronospora farinosa(Fr.)Fr.f.sp.betae Byford)是我国重要的植物检疫性病原菌，对甜菜生产的危害极大，其病原菌属鞭毛菌亚门，霜霉目，霜霉属，粉霜霉。主要侵染甜菜地上部幼嫩器官，多为害心叶，感病叶片初为浅绿色后为黄色至褐色的不规则形病斑。在潮湿条件下，病斑背面长有灰紫色的霉层，为病原菌从气孔中伸出的菌丝、孢囊梗和孢囊孢子。该病害在以色列、前苏联、肯尼亚、摩洛哥、加拿大、美国、阿根廷、澳大利亚、新西兰等国家均有分布。1997年甜菜霜霉病菌列入我国检疫性有害生物目录，据国内学者调查报道，该病害发生区为西南三省叶用甜菜和新疆伊犁地区糖用甜菜，上世纪90年代新疆糖用甜菜霜霉病引起学者广泛关注，并对其病原形态特征、危害状、发病流行规律及检疫防治措施进行了研究和报道。

糖用甜菜是仅次于甘蔗的重要糖料作物，我国最大的甜菜糖产区在新疆，年产糖50万吨左右。近几年新疆甜菜制种基地减少，甜菜霜霉病随环境气候小面积零星发生，但我国每年从美国、德国、法国、荷兰等国进口大量甜菜种子，可能携带的检疫性有害生物严重威胁我国甜菜产业的生产安全，如何高效快速检测成为预防甜菜霜霉病传入、扩散的技术关键。荧光定量PCR已广泛用于植物病原真菌、细菌、病毒检测等诸多领域，TaqMan-MGB探针由于3′端具有MGB分子，提高了探针了Tm值(平均15nt可提高18℃)，探针长度可缩短13～15nt左右，解决了单碱基差异探针设计的难题。甜菜霜霉病菌不可培养，检测方法主要是PCR方法，而传统PCR方法存在特异性不强等缺点，难以满足实际检测的需要。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于检测或辅助检测甜菜霜霉病菌的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括由序列表中序列1所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子组成的引物对。

上述试剂盒还包括探针，所述探针的核苷酸序列为序列表中序列3。

上述试剂盒中，所述探针的5′末端标记荧光基团，且3′末端标记淬灭基团。

上述试剂盒中，所述序列表中序列1所示的DNA分子、所述序列表中序列2所示的DNA分子和所述探针的摩尔比为2-6:2-6:1，所述序列表中序列1所示的DNA分子、所述序列表中序列2所示的DNA分子和所述探针的摩尔比具体为4:4:1。

本发明的另一个目的是提供用于检测或辅助检测甜菜霜霉病菌的PCR试剂。

本发明提供的PCR试剂，包括上述引物对和所述探针；所述引物对中各引物在所述PCR试剂中的终浓度为0.2-0.6μmol/L，所述探针在所述PCR试剂中的终浓度为0.05-0.3μmol/L；

所述引物对中各引物在所述PCR试剂中的终浓度具体为0.4μmol/L，所述探针在所述PCR试剂中的终浓度具体为0.1μmol/L。

上述的试剂盒或上述的PCR试剂在检测或辅助检测甜菜霜霉病菌中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的试剂盒或上述的PCR试剂在制备检测或辅助检测甜菜霜霉病菌产品中的应用也是本发明保护的范围。