[发明专利]微生物鉴定用质谱仪分子量校正标准品及其制备方法与应用

说明书

本发明提供一种微生物鉴定用质谱仪分子量校正标准品及其制备方法与应用，涉及微生物肽质量指纹谱的基质辅助激光解析飞行时间质谱鉴定技术领域。本发明基于基质辅助激光解析飞行时间质谱技术，通过对多种大肠杆菌的组合与优化，提供一种依据多种大肠杆菌的优化肽序列，以该序列谱为基础构建适用于目前商业化质谱微生物鉴定系统的校正标准品。本发明提供的标准品制备方法简单、成本低廉，利用其作为微生物鉴定的质谱仪分子量校正标准品，具有稳定性好、便于操作、校正时间短、重复性好的优点，且校正峰的肽序列丰富，准确度高，能够解决目前微生物鉴定用质谱仪校正标准品获得困难或操作条件苛刻的问题，具有良好的经济价值和应用前景。

技术领域

本发明涉及基于肽质量指纹谱的基质辅助激光解析飞行时间质谱鉴定微生物的技术领域，具体地，涉及微生物鉴定用质谱仪分子量校正标准品及其制备方法与应用。

背景技术

病原体的快速、准确识别是临床感染诊断、传染病预防控制、食品安全等公共卫生问题的关键因素。随着软电离技术的发展，基于肽质量指纹谱的基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)微生物识别技术也随之问世。该技术是在完整的微生物中添加酸性基质辅助细胞裂解，激光激发细胞裂解物(小蛋白或多肽)形成肽质量指纹谱，与已构建的属、种水平的共性参考谱库进行比对分析，从而实现微生物的鉴定。其快速、自动化、高通量、准确的特性已使其在全球临床诊断、质检、传染病监测、食品安全等领域占有一席之地。目前商业化的质谱微生物鉴定系统有布鲁克公司的Microflex/Auto-Biotyper及岛津公司的AXIMA Assurance-SRAMIS/VITEK MS系统。

质谱仪采集样本的准确性是肽质量指纹谱微生物识别体系的关键因素。而仪器校正用标准品决定质谱仪采样的准确性。目前商业化的微生物鉴定用质谱仪校正标准品只有布鲁克公司的Bruker Bacterial Test Standard(BTS255343)。鉴于病原微生物的敏感性，该标准品因涉及病原菌及其提取物，国内购进手续繁琐、价格昂贵。微生物鉴定用质谱仪分子量校正，不同厂家给出的方案不同。布鲁克公司采用大肠杆菌提取物，现用现提，需反复培养大肠杆菌；且每个用户使用的菌株不同，对各个实验室检测结果平行性比对造成影响。岛津公司采用大肠杆菌8739菌落直接涂抹，菌株需新鲜培养且传代不超过7次。由于基质与菌落直接结合，结晶均一性差；且人工涂抹菌落，造成每个样本点均一性较差。这两个因素造成校正点稳定性不够好，系统采集谱图较为困难，校正时间长；谱图基线较高，在10,000至14,000Da范围内峰数明显减少，尤其大于12,000Da没有峰出现，直接造成校正匹配漏点增多，尤其是高质量数的校正峰。以上这些因素均会直接影响微生物的鉴定结果。

发明内容

本发明的目的是为了弥补目前微生物鉴定用质谱仪分子量校正品难以获得或者校正过程费时、费力且效果不稳定等不足之处，提供一种成本低廉、校正谱图优质、校正效果稳定的微生物鉴定用质谱仪分子量校正品。

本发明的另一目的是提供一种用于微生物鉴定用质谱仪分子量校正的试剂盒。

本发明提供的微生物鉴定用质谱仪分子量校正标准品，含有大肠杆菌(Escherichia coli)特征蛋白，该特征蛋白的质荷比m/z分别为：2094，2466，3149，4364，5095，5380，6241，6254，6315，6410，6856，7157，7273，7872，8368，9742，10137，10299，12227。

进一步地，本发明的微生物鉴定用质谱仪分子量校正标准品通过以下方法制备得到：

(1)选择大肠杆菌ATCC8739、MG1655、JM109，将三株菌培养至对数生长期后，收集菌株，按照质量比3-8：1-5:1-3将三者混合；

本发明从85株大肠杆菌中筛选了9株菌，进一步优化组合后确定了3株菌，即上述的ATCC8739、MG1655、JM109，并优化了这3株菌的配比。