[发明专利]一种糖肽芯片及其制备方法

权利要求书

1.一种糖肽芯片制备方法，其特征在于，用凝集素滤膜辅助法从自然来源的样本中分离出糖肽，利用糖肽上肽的N-端或氨基酸残基上的氨基，以N-C键形式共价偶联到环氧化衍生化的固相载体上，具体是：先将蛋白用活化胰蛋白酶trypsin酶解得蛋白酶解液；再向蛋白酶解液加入凝集素，清洗、洗脱选择性分离蛋白酶解液中的糖蛋白，得到特异性分离的糖肽；利用所述特异性分离的糖肽制成点样液，将点样液加到384孔板内，再用点样仪在环氧化片基上点制4区的阵列，得到糖肽芯片。

2.根据权利要求1所述糖肽芯片制备方法，其特征在于，所述包括蛋白酶解具体是：取蛋白样品1～1.5mg，加入离心管中，进行离心浓缩，再加入弱碱性清洗液，再次离心，终体积100μL，离心产物用500μL终浓度8M尿素溶解、室温静置至少30min，浓缩离心至100μL，再加入200μL 10mmol/L的DTT溶液进行水浴，水浴后加入100μL 20mmol/L IAM溶液，避光静置，再加入100μL 10mmol/L的DTT溶液后进行水浴，水浴结束后加入0.125mg/mL的活化胰蛋白酶trypsin，酶解过夜，酶解后高温加热，离心收集离心液，得到蛋白酶解液。

3.根据权利要求1所述糖肽芯片制备方法，其特征在于，所述选择性分离蛋白酶解液中的糖蛋白具体是：取300μg凝集素加入到蛋白酶解液中，空气震荡浴中室温反应3h，转移至30KD离心柱中，通过用结合缓冲液的反复清洗，600μL/次，洗去非特异性吸附的蛋白质，然后加入300μL洗脱缓冲液，Con A的洗脱缓冲液为含有0.5mol/L α-甲基甘露糖苷的缓冲液，LCA的洗脱缓冲液为含有 0.2mol/L 岩藻糖的缓冲液，空气震荡浴中洗脱1h，收集洗脱液，即得到从样本中特异性分离的糖肽。

4.根据权利要求1所述糖肽芯片制备方法，其特征在于，所述糖肽芯片的点制的具体步骤是：

1）将纯化的糖肽配制成点样液，该点样液的有效成分为具有一类糖链结构的糖肽；

2）将配制的点样液加到384孔板内，再用点样仪在环氧化片基上点制4区的阵列；

3)将点制好的芯片在湿度为40%～60%的环境中孵育过夜；对孵育好的芯片在37℃的真空干燥器中抽真空3小时或者60℃的真空干燥器中抽真空1小时，使糖肽固定于芯片上；

4)将固定好的糖肽芯片放置在干燥器中, 避光保存；称量0.02g/mLBSA溶入pH7.4的磷酸盐缓冲液-吐温20中，溶解混匀后用0.2μm的滤膜过滤，将制备好的糖肽芯片置于封闭液中1小时；

5)将封闭后的糖肽芯片用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别依次清洗1次，每次5分钟，再经甩干后备用；

6)对甩干后的糖肽芯片加入600～700μL的孵育缓冲液，作为与待测样本的反应环境；

所述磷酸盐缓冲液pH7.4以1L总量计，组分为：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g， Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g；

所述磷酸盐缓冲液-吐温20是还含有质量分数0.05吐温20的所述磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求2所述的糖肽芯片制备方法，其特征在于：所述蛋白酶解过程中弱碱性清洗液采用100mmol/L NH₄HCO₃。

6.根据权利要求3所述的糖肽芯片制备方法，其特征在于：所述蛋白酶解过程中所有离心均采用10KD离心柱，柱温4℃，14,000g离心，离心时间15min。

7.根据权利要求5所述的糖肽芯片制备方法，其特征在于：所述蛋白酶解过程中加入弱碱性清洗液并再次离心的处理重复两次。

8.根据权利要求2所述的糖肽芯片制备方法，其特征在于：所述蛋白酶解过程中所有水浴处理中均为水浴温度37℃、时间1h。

9.根据权利要求4所述的糖肽芯片制备方法，其特征在于：所述蛋白酶解过程IAM溶液避光保存，避光室温静置1h。

10.根据权利要求1～9任一项所述的糖肽芯片制备方法，其特征在于：所述蛋白酶解过程中活化胰蛋白酶trypsin与蛋白的质量之比蛋白酶:蛋白=1:100，且用25mmol/L NH₄HCO₃稀释。