[发明专利]一种糖肽芯片及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴别疾病的糖肽芯片。

背景技术

糖芯片是研究糖组学以及糖结合蛋白（glycan- binding protein, GBP）与糖链相互作用的最有效的高通量分析工具，其潜在的应用范围非常广泛，例如包括筛选GBP、抗体特异性分析、细菌和病毒的粘附以及酶的特性分析等方面。糖芯片也能帮助研究者发展新的诊断方法和监测疾病状态以及发展治疗疾病的药物。糖芯片正在变成一种标准的研究方法用于大规模筛选糖和阐明糖在生物系统中所扮演的角色。例如糖芯片技术用于了禽流感方面的研究，用于快速监测当前H5N1禽流感亚型的爆发以及评估病毒变异对人类潜在的威胁性。

目前，所报道的糖芯片的制备方法有三种，第一种是以物理吸附的方法将糖链固定到固相载体上；另一种是对糖链进一步化学修饰，然后再把经修饰的糖链共价偶联到诸如硝酸纤维素膜或玻片等固相载体上。这两种方法存在如下缺点：如果用物理吸附的方法来制备糖芯片，则固定在固相载体上的糖链在实验过程中易脱落，影响结果的准确性；对糖链进一步化学修饰（氨基化或巯基化）和纯化，然后再把糖共价偶联到诸如表面醛基或羧基化的硝酸纤维素膜或玻片等固相载体上，该方法过程复杂，成本高，实用性差。第三种制备糖芯片的方法是利用糖链的还原末端，以肟基共价偶联其到-O-NH₂衍生化的玻片上或以糖苷键的形式价偶联其到羟基衍生化的玻片上，由于糖链的来源（分离或合成）困难，这些糖芯片制备成本较高。

目前糖芯片制备的原料主要是糖链，技术涉及糖链的固定化、糖结合蛋白的高通量表达及糖芯片的检测与分析等部分。对于哺乳动物而言，其体内的糖类主要由大约10种常见的单糖单位组成，同时具有线性和分支结构，并且包含α和β两种立体构型，这使得糖链具有极高的潜在的复杂性。据计算，哺乳动物中可能的糖链类型可以达到大约1012种，实际中发现的N连接的糖链已经超过2000种，并且这一数字目前还在不断增加. 由于糖芯片要将糖链固定于载体上并作为检测中特异性的“探针”，糖芯片的发展很大程度上依赖于糖链，获得大量的适合制备芯片需要的糖链是首要的问题。

糖类的分离对于分析糖组中糖链的序列及其生理功能非常重要，然而自然来源的糖类非常有限，特别是需要大量纯度很高的糖的时候。发展能够大量、高效的从自然界分离纯度较高的聚糖的方法对于糖文库的建立非常重要。另一方面，多糖或寡糖可以通过多步生物合成结合化学和生物催化方法进行，这对于自然来源糖类的不足可以起到补充作用。对于糖类合成的研究已经持续了一个多世纪，经过大量的研究工作，现在许多寡糖已经可以人工合成。然而由于糖类结构的复杂性的不同，专业的实验室合成某些寡糖可能需要数月甚至数年时间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备成本低，能更好的反应糖链与其结合蛋白作用的自然状态，降低识别的非特异性，解决固定效率低，结合特异性不真实的一种糖肽芯片及其制备方法。

本发明提供一种糖肽芯片制备方法，用凝集素滤膜辅助法从自然来源的样本中分离出糖肽，利用糖肽上肽的N-端或氨基酸残基上的氨基，以N-C键形式共价偶联到环氧化衍生化的固相载体上，具体是：先将蛋白用活化胰蛋白酶trypsin酶解得蛋白酶解液；再向蛋白酶解液加入凝集素，清洗、洗脱选择性分离蛋白酶解液中的糖蛋白，得到特异性分离的糖肽；利用所述特异性分离的糖肽制成点样液，将点样液加到384孔板内，再用点样仪在环氧化片基上点制4区的阵列，得到糖肽芯片。

所述包括蛋白酶解具体是：取蛋白样品1～1.5mg，加入离心管中，进行离心浓缩，再加入弱碱性清洗液，再次离心，终体积100μL，离心产物用500μL终浓度8M尿素溶解、室温静置至少30min，浓缩离心至100μL，再加入200μL 10mmol/L的DTT（二硫苏糖醇）溶液进行水浴，水浴后加入100μL 20mmol/L IAM（碘乙酰胺）溶液，避光静置，再加入100μL 10mmol/L的DTT溶液后进行水浴，水浴结束后加入0.125mg/mL的活化胰蛋白酶trypsin，酶解过夜，酶解后高温加热，离心收集离心液，得到蛋白酶解液。