[发明专利]一种增强脂肪间充质干细胞免疫学性能和迁移能力的方法

权利要求书

1.一种增强脂肪间充质干细胞免疫学性能和迁移能力的方法，其特征在于，步骤如下：将分离提取的脂肪间充质干细胞原代培养至80％融合，再进行传代培养，选用生长良好的第三代细胞，用含有TLR3激活剂Poly(I:C)的细胞培养液进行共培养，最后进行实验组和对照组的Real-time PCR和趋化性实验对比检测；

(1)脂肪间充质干细胞的分离及原代培养

从小鼠腹股沟部剪取脂肪组织，用HBSS缓冲液冲洗，充分剪碎，加入0.1％I型胶原酶进行消化，然后过滤并离心10min得到的细胞生长培养液；对细胞生长培养液进行重悬沉淀得到细胞悬液，将细胞悬液接种到培养瓶中，置于5％CO₂细胞培养箱中进行原代培养；

(2)脂肪间充质干细胞的传代培养

待步骤(1)原代培养至80％融合，用含0.25g/100mL EDTA的胰蛋白酶液进行消化，重悬细胞，然后接种到培养皿中传代培养；待细胞培养至80％融合后，进行传下一代培养，得到第三代脂肪间充质干细胞；

(3)POLY(I:C)对脂肪间充质干细胞的刺激

用含有TLR3激活剂Poly(I:C)的细胞生长培养液培养步骤(2)培养1h，得到的第三代脂肪间充质干细胞，然后用含0.25g/100mL EDTA的胰蛋白酶液进行消化，重悬细胞；所述的含有TLR3激活剂Poly(I:C)的细胞生长培养液中Poly(I:C)的含量为1μg/mL；细胞生长培养液中含有L-谷氨酸钠2mM、三抗的体积百分数1％、胎牛血清的体积百分数10％；含有TLR3激活剂Poly(I:C)的细胞生长培养液为DMEM/F121:1培养基；

(4)Real-time PCR检测细胞因子和趋化因子的表达

利用Real-time PCR方法分别对经过Poly(I:C)共培养后的脂肪间充质干细胞和未经Poly(I:C)刺激的脂肪间充质干细胞进行对比实验，对二者IL-6、TGF-β、MCP-1、KC、Eotaxin-1、VEGF细胞因子或趋化因子mRAN表达水平进行检测；

(5)体外趋化性试验

利用transwell小室进行细胞侵袭试验，分别取生长至80％融合的经过Poly(I:C)共培养后的脂肪间充质干细胞和未经Poly(I:C)刺激的脂肪间充质干细胞，接种于小室滤膜上方；下室中加入占小孔体积25％的细胞生长培养液，过夜孵育，然后取下小室，用PBS缓冲液小心淋洗滤膜下层，棉签擦去滤膜上层细胞及杂质；钙黄绿素染色，进行荧光分析。