[发明专利]一种水稻工程保持系的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，包括：

步骤一、将外源报告基因定点整合到野生型水稻的染色体上得到含有外源报告基因的转基因株系，其中，该外源报告基因与野生型育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及，之后进入步骤二，

步骤二、将步骤一中得到的转基因株系与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交，筛选含有所述外源报告基因的株系即为所需要的水稻工程保持系，其中，该纯合隐性水稻普通雄性核不育株系为所述育性调控基因突变体株系；

所述步骤一中，获得含有外源报告基因的转基因株系的具体方法包括：

(1.1)分析野生型水稻染色体上育性调控基因的上下游序列区域，取该区域内NGG前面的20bp作为靶位点区域，并设计与该靶位点区域配对的引物序列，在引物上游序列前加GCAA，在引物下游序列前加AAAC，得到引物:

上游序列：5’–GCAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3’

下游序列：5’–AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3’，其中“N”指代碱基A、T、C或G；

(1.2)根据CRISPR/Cas9系统，将步骤(1.1)中的引物序列构建到pP1C.1载体上得到基因整合载体；

(1.3)将外源报告基因构建到植物表达载体上得到重组表达载体；

(1.4)将所述重组表达载体和所述基因整合载体共转化野生型水稻，得到转基因植株；

(1.5)在靶位点两翼设计引物，以转基因植株基因组进行扩增，若扩增产物片段大小与外源报告基因片段大小大致相等，则判定该植株为含有外源报告基因的水稻转基因株系，并且在靶位点定点插入整合。

2.如权利要求1所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，在所述步骤一之前还包括：通过图位克隆确定出纯合隐性水稻普通雄性核不育株系中突变型育性调控基因在染色体上的位置。

3.如权利要求1所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，所述重组表达载体中，所述外源报告基因的核苷酸序列前构建有水稻胚乳特异性启动子Gt1。

4.如权利要求1所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，所述育性调控基因为水稻EAT1基因。

5.如权利要求4所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，所述步骤(1.1)中的引物序列为：

上游序列：5’–GCAAGAGCGAGAGGGGAAGCATTT–3’

下游序列：5’–AAACAAATGCTTCCCCTCTCGCTC–3’。

6.如权利要求1所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，所述外源报告基因为红色荧光标记基因、红色荧光蛋白标记基因、绿色荧光蛋白基因、或蓝色荧光标记基因中的任意一种。

7.水稻工程保持系在水稻育种中的应用，其特征在于，所述水稻工程保持系由如权利要求1至6任一所述的方法获得。