[发明专利]一种水稻工程保持系的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种水稻工程保持系的构建方法及其应用。

背景技术

水稻杂种优势利用是提高水稻产量最有效的途径。“三系法”杂交水稻对种质资源利用率低以及“两系法”杂交水稻杂交制种安全性约束是影响杂交水稻种植推广面积进一步扩大的重要因素。发明新的育种技术,开发出对种质资源利用率高、杂交制种安全的水稻杂种优势利用方法是杂交水稻发展的方向。普通隐性核不育材料不育性稳定、杂交制种安全，易于配制高产、优质、多抗组合；共同的缺点是无法实现不育系种子的批量繁殖。

针对隐性核雄性不育材料的繁殖问题，育种家也先后提出多种解决方案,主要包括：(1)根据雄性不育机理，通过施加缺失的代谢中间物质(如氨基酸、黄酮、脂肪酸等物质)，使突变不育株恢复育性而得以繁殖；(2)在雄性不育株中，利用条件控制(如诱导性)启动子驱动育性恢复基因表达，给予适合的启动子表达条件时，育性恢复基因表达,育性恢复而得以繁殖；而不给予适合启动子表达的条件时，育性恢复基因不表达，即为不育系。此外，也可以利用条件控制启动子驱动作物内源育性基因的抑制因子表达而达到上述同样的目的。以上这些方案在不同作物的实际生产中得到了不同程度的应用，但由于不育系的育性转换不能被完全精确地控制，或者不育系中含有转基因成分并因而造成杂交种中含有转基因等问题，都没有得到广泛的应用。

随着分子设计育种思想和技术的进步，开发能够精确控制的不带转基因成分的不育系的繁殖技术，成为分子设计杂交育种技术领域亟需解决的问题。1993年6月11日，国外生物技术公司PLANT GENETIC SYSTEM提出了一项PCT专利申请，该专利提出以下技术思想：在隐性雄性不育植株中导入连锁表达的育性恢复基因、花粉致死(败育)基因以及筛选标记基因(如荧光蛋白基因)三套元件，可以获得该雄性不育植株的保持系，保持系通过自交就可以实现不育系和保持系的繁殖。2002年，Perez-Prat等人提出，可以通过在纯合的雄性不育植株中导入连锁表达的育性恢复基因和筛选标记基因两套元件，由此获得该雄性不育植株的保持系，保持系与不育株杂交即可繁殖不育系和保持系。两种方法提出了利用精确的分子生物技术手段，解决隐性核雄性不育基因及不育材料的应用问题，为开展分子设计杂交育种提供了技术框架。相比较而言，三元件系统考虑到花粉逃逸和转基因生态风险的问题,较双元件系统思路更加缜密。2006年，美国杜邦先锋公司在三元件系统技术思路基础上，首先在玉米中实现了基于核不育突变材料的种子生产技术，并命名为Seed Production Technology(SPT)技术。2010年9月，在中国科技部“国家高技术研究发展计划”的支持下，三元件系统技术思想在水稻中得到了证实和应用，并被称之为“智能不育杂交育种技术”或“第三代杂交水稻技术”。通过项目的实施，将有力推动智能不育分子设计技术在作物育种中的研究应用，使我国在水稻杂交育种领域继续保持国际领先优势，为促进生物育种产业的发展提供技术和产品支持。

从思路上来说，SPT技术几乎完美，既可以实现普通核不育系的繁殖，又可以消除人们对于转基因风险的担忧，因为杂交后代植株中没有外源的转基因元件，不存在转基因生物安全问题。但是在实际操作过程中会遇到以下几个问题：(1)转化受体取材受到限制，因为互补载体要转化到不育植株中去，因此只有选择不育水稻植株的幼穗诱导愈伤组织；取材受到很大限制，并且有效取材时间很短；(2)育性恢复基因的导入对突变不育株的表型恢复并不十分理想，对于后续的制种产量影响很大。原因可能与载体序列在受体基因组上的插入位点有关，侧翼序列的特征对育性恢复基因的表达水平可能会有影响。

发明内容

本发明的一个目的克服现有技术的不足，并提供至少后面将说明的优点。

本发明另一个目的是提供一种水稻工程保持系的构建方法，本发明通过CRISPR/Cas9系统将外源报告基因整合到野生型水稻的染色体上，解决了转化受体材料受限制的问题。

本发明还有一个目的提高水稻工程保持系在水稻育种中的应用，本发明的水稻工程保持系可用于水稻普通隐性雄性核不育系繁殖中，培育后的水稻工程保持系产品可机械化、规模化应用于水稻普通核不育系的繁殖制种中，且过程简单、操作方便。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种水稻工程保持系的构建方法，包括：

步骤一、将外源报告基因定点整合到野生型水稻的染色体上得到含有外源报告基因的转基因株系，其中，该外源报告基因与野生型育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及，之后进入步骤二，