[发明专利]一株戊糖片球菌P9-5及其筛选鉴定和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株微生物、筛选鉴定及应用，特别涉及一株戊糖片球菌P9-5、筛选鉴定及在抗单核细胞增生李斯特氏菌中的应用，属于微生物的检测及应用技术领域。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）广泛存在于自然界中，肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是单增李斯特氏菌的感染源，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，对环境及理化因素的适应能力非常强，耐高温、耐酸、耐低温，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

随着近年来世界范围内发生的多起单核细胞增生李斯特氏菌引起的中毒事件以及由此而带来的危害，使得预防和控制食品中的单增李斯特氏菌成为了人们关注的热点。在研究中发现，某些乳酸菌对单核细胞增生李斯特氏菌具有抑制活性。乳酸菌是一类能从可发酵性碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性菌的统称，是人和动物肠道正常菌群中的优势菌，不仅具有许多有益的生理功能，而且能够产生有机酸、过氧化氢和细菌素等抑菌物质。细菌素是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的具有抑菌活性的多肽或前体多肽，产生菌对其自身分泌的细菌素具有免疫作用。在研究中发现，某些乳酸菌细菌素对单增李斯特氏菌具有强烈的抑制作用，因此这类细菌素引起了人们特别的关注，这些细菌素通常都属于Ⅱa类细菌素。它经济、有效、并且不会对环境造成二次污染，有望从源头上对单核细胞增生李斯特氏菌污染加以控制。

到目前为止，国内还没有开发出成型、经济的生物制剂产品。生物制剂作为单核细胞增生李斯特氏菌控制的一种很好的手段急需加以研究和开发。

发明内容

    本发明所要解决的技术问题在于针对以上不足，提供一株戊糖片球菌P9-5及其筛选鉴定和应用，实现以下目的：

1、通过筛选抗单核细胞增生李斯特氏菌的乳酸菌菌株；抗单核细胞增生李斯特氏菌菌株的筛选工作，建立合理、有效的单核细胞增生李斯特氏菌拮抗乳酸菌株的筛选方法。

2、提高食品及环境中单核细胞增生李斯特氏菌污染的防控水平。

3、为控制单核细胞增生李斯特氏菌提供更多选择。

4、提供对单核细胞增生李斯特氏菌具有拮抗作用的戊糖片球菌P9-5。

5、为出入境食品的单核细胞增生李斯特氏菌检验检疫提供可靠有效的检测手段。

该菌株于2015年3月6日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.10573，分类命名：戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）P9-5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.10573。

基于以上所述戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）P9-5，本发明提供所述戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）P9-5在抗单核细胞增生李斯特氏菌中的应用。

基于以上所述戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）P9-5，所述戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）P9-5的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤a：乳酸菌的分离纯化；

步骤b：乳酸菌的筛选；

步骤c：抗单核细胞增生李斯特氏菌菌株的初筛；

步骤d：抗单核细胞增生李斯特氏菌菌株的复筛。

一种优化方案，所述步骤a包括：称取样品25g，加入225ml MRS液体培养基，37℃培养48h，混合均匀后分别用微量移液器吸取1ml培养液用生理盐水稀释10^-1-10^-6六个梯度，取10^-4，10^-5，10^-6三个浓度各0.1ml涂布MRS平板，37℃培养24h，挑取单菌落纯化。

进一步地，所述步骤b包括：采用反相高效液相色谱法测定纯化后的菌落发酵液中的乳酸含量；

挑取纯化后的菌落于MRS液体培养基中，37℃培养48h后，取发酵液5mL，8000r/min离心10min，除去菌体，加入5mL 0.01mol/L的硫酸水溶液进行酸解，离心除去硫酸钙，以0.22μm的滤膜过滤，取1mL滤液稀释10倍即得到待测液供上机检测；