[发明专利]一种基于BioLog微平板的原生奶嗜冷菌的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体包括一种基于BioLog微平板的原生奶嗜冷菌的快速检测方法。

背景技术

鲜乳中的嗜冷菌主要是由于榨乳用具不清洁和杀菌不彻底引起，不同的榨乳、贮藏和运输方式对嗜冷菌的含量影响较大。在最初的细菌总数中嗜冷菌占10%～50%，而在随后的低温贮藏过程中，嗜温菌、嗜热菌等的生长、繁殖受到抑制，嗜冷菌就成为生鲜乳中的优势菌，从而产生嗜冷菌污染。嗜冷菌污染是现代乳制品加工过程中最常见，也是最难解决的问题之一。大多数嗜冷菌在低温贮藏时产生耐热性的胞外蛋白酶，这些酶能耐受巴氏消毒甚至UHT处理，使乳产生凝胶、沉淀、苦味、酸败等不良现象的同时影响产品的色泽，导致乳及乳制品风味、质地的变异，缩短保质期，从而影响产品的质量及加工过程的顺利进行。

嗜冷菌中细菌数量和种类最多，广泛分布在各种低温环境中，在已分离出的嗜冷菌中细菌是最多的一类，大多数为革兰氏阴性菌。比较常见的大致可分为以下几个种属：假单胞菌属(Pseudomonas)、肠道菌属(Enterbacteriaceae)、黄杆菌属(FLarobacterium)、色杆菌属(hromobacterium)、产碱杆菌属(ALcaLigenes)、微球菌(Micrococcus)、链球菌属(Streptococcus)和乳杆菌属(LactobaciLLus)等。目前从乳中分离的嗜冷菌主要有假单胞菌属、产碱杆菌属、无色杆菌属、黄杆菌属、克雷伯氏杆菌属及小球菌属等，其中大部分可产生降解牛乳成分的胞外酶。嗜冷菌胞外蛋白酶耐热的机理在于经过高温处理后，未被破坏的处于非折叠状态的蛋白酶分子（无活性）重新折叠成有活性的天然构象。因此原生奶中一旦产生此类酶后无法通过单一的热处理完全灭活，即能够耐受巴氏灭菌（72℃/15s）和超高温（UHT）（120～150℃/0.5～8s）灭菌工艺处理，引起牛乳腐败变质，给乳品加工企业提出一个大的难题。

要减少嗜冷菌的危害，早期对牛奶原料中嗜冷菌的检测和控制是关键。目前国内外检测嗜冷菌的方法主要有：1、传统的低温培养平板检测及其改良方法；2、直接检测法，包括外荧光过滤（DEFT）、流式细胞计数（FCM）、实时PCR检测（RT-PCR）、荧光原位杂交探针（FISH）、瞬时温度梯度凝胶电泳（TTGE）、ATP生物发光等；3、间接检测法、包括游离脂肪酸测定、氨肽酶活性测定、内毒素检测、酶联免疫吸附法、电阻抗法、石英晶体微天平等。但由于嗜冷菌定义并不明确，种类多样， 缺乏统一的标准，属于不同科、属的嗜冷菌之间性状差异较大，当前国内外尚无统一的标准，目前低温培养平板检测是完全筛选出嗜冷菌并进行全面计数的最准确方法， 其他方法均存在只能对总菌数进行计数或者只能对某一属（种）特定菌进行计数的问题。因此在生命科学飞速发展的今天，急需利用现代生物学技术，开展嗜冷菌的快速鉴定技术，这对分析当地嗜冷菌种类，从而采取相应的控制措施具有重要的指导作用。

嗜冷菌污染是现代乳制品加工过程中最常见的问题，大多数嗜冷菌在贮存时能产生耐热的酶类，这些酶能耐受巴氏消毒甚至UHT处理，导致乳及乳制品风味、品质降低，保质期缩短，甚至危及加工过程的顺利进行，从而影响产品的质量及加工过程的顺利进行。开展嗜冷菌的快速检测和鉴定技术，及时而有有针对性地采取相应的措施，对提高乳制品品质，延长保质期，具有重要的意义，不同地区、和不同的奶牛饲养方法等对嗜冷菌种类和数量都具有一定的影响，因此无论何地，也无论何种饲养和管理方法，牛奶中或多或少都可能会有嗜冷菌污染，无非是嗜冷菌种类和数量上的差异。不同厂家以及不同的鉴定方法等对嗜冷菌种类和数量的鉴定和检测具有一定的影响，即使同一地区，由于各种原因也会造成牛乳中嗜冷菌种类和数量才在一定的差异，传统的鉴定方法费时费力，急需研究快速准确的嗜冷菌鉴定方法来指导牛乳乳制品的生产。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于BioLog微平板的原生奶嗜冷菌的快速检测方法的技术方案。

所述的一种基于BioLog微平板的原生奶嗜冷菌的快速检测方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）原生奶嗜冷菌的分离纯化；

2）Biolog快速鉴定法的菌悬液的制备；

3）Biolog快速鉴定法的加样和培养；

4）通过Biolog微生物鉴定，自动和数据库对比，确定该原生奶嗜冷菌的种属。