[发明专利]牛奶中抗生素残留的检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及牛奶中抗生素残留的监测方法及其应用，属于食品安全领域，特别是食品安全检测领域。

背景技术

牛奶富含除了膳食纤维外的人体所需要的所有营养物质，其营养之高是其他食物不可替代的。新鲜牛奶和奶制品已经成为人们(尤其是老人和儿童)生活食品中的重要组成部分。近年来，随着我国畜牧养殖业的迅速发展，奶产量大幅度提高，为了预防疾病的发生和治疗乳房炎等疾病，养殖者会在牛饲料中及饮用水中添加含有一定比例抗生素的饲料添加剂，然而，这样将不可避免地造成牛奶中抗生素的残留。若长期饮用含有抗生素的牛奶，牛奶中的抗生素可通过食物链进入人体，无疑是等于长期服用小剂量的抗生素。对抗生素过敏体质的人服用残留抗生素的牛奶后可引发过敏反应。正常饮用者，会导致体内的某些条件性致病菌易产生耐药性，一旦患病再用同种抗生素治疗很难奏效。抗生素残留不仅危害人类健康，同时也影响牛奶的品质。世界粮农组织(FAO)、世界卫生组织(WHO)的食品法对牛奶中抗生素最高残留量作了详细的规定。我国农业部2001年颁布实施了《无公害食品生鲜牛乳行业标准》。因此，建立一种，简单、快速、有效地检测牛奶中多种抗生素残留的方法是非要必要的。

由于磺胺类、喹诺酮类、β-内酰胺类、四环素类、氯霉素类共5大类33种兽药的药物，其化学分子结构和化学性质差异较大，同时对牛奶中多种抗生素残留的同时检测有一定困难，目前还没有文献报道。对于牛奶中抗生素残留分析，固相萃取技术、固相微萃取技术以及基质固相分散等前处理技术已经被应用到样品前处理步骤中，以用来解决样品分析测试中的基质干扰问题。其中，固相萃取技术的应用最为广泛，但是应用在牛奶中抗生素残留检测的前处理中，固相萃取技术却普遍存在样品处理过程复杂、有毒试剂接触多、耗材消耗量大、需要额外氮吹、重现性差和无法实现全自动联机等问题。特别是四环素类等药物，由于其与蛋白质或者矿物质结合，形成结合态，因此更加加重了牛奶中残留抗生素的检测难度。

发明内容

本发明的目的在于针对目前牛奶中抗生素残留的检测问题，提供一种简单、快速的检测方法，从而可以同时检测牛奶中磺胺类、喹诺酮类、β-内酰胺类、四环素类、氯霉素类共五大类33种兽药残留。

本发明所公开的牛奶中抗生素残留的检测方法，为在线固相萃取—高效液相色谱—质谱联用检测方法。

其中：在线固相萃取采用C18柱或者HLB柱，所述在线固相萃取的淋洗程序包括以下步骤，首先依次通过甲醇-水-缓冲溶液活化，具体程序为，甲醇以5mL/min的淋洗速度淋洗0.2min，水以5mL/min的淋洗速度淋洗0.4min，缓冲溶液以5mL/min的淋洗速度淋洗0.6min，然后将待测牛奶样品上样，具体程序为，水以0.5mL/min的淋洗速度淋洗1.6min，之后利用甲醇进行洗脱，具体程序为，甲醇以0.15mL/min的淋洗速度淋洗2.6min，最后先后通过水—甲醇进行冲洗，具体程序为，水以5mL/min的淋洗速度淋洗2.8min，而后甲醇以5mL/min的淋洗速度淋洗3.0min，

这里我们使用的缓冲溶液为磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐中的任意一种。

所述高效液相色谱采用C18分析柱，柱温为30°，采用甲酸水/甲醇作为洗脱液，利用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱梯度以体积计分别为95:5、75:25、5:95、95:5，各梯度洗脱时间分别为2.5min、3.5min、4.0min、2.5min。

所述质谱采用离子化电喷雾，电喷雾离子源为HESI-II，毛细管温度为350℃，鞘气流速50L/min，辅助气流速6L/min，吹扫气流速3L/min，喷雾电压为3KV，透镜电压为50V，采用正离子和负离子模式分别采集数据或者正负离子同时切换采集数据，一级全扫描的分辨率R＝70000，扫描范围100～1000m/z。

进一步地，我们还公开了所述待测牛奶样品的制法为：(1)将待测牛奶与蛋白沉淀剂混合均匀，向混合均匀后的溶液中加入缓冲溶液，调节pH至3.5～7.5，(2)将步骤(1)得到的混合物离心、过滤，收集上清液，即为待测牛奶样品。其中优选以下任意一种或者几种优选条件，

所述蛋白沉淀剂的加入量为待测牛奶加入重量的0.2～5倍，

所述蛋白沉淀剂优选为乙酸锌水溶液、乙酸铅水溶液、乙酸铵溶液、三氯乙酸溶液、甲醇、乙腈或者冰乙酸水溶液中的任意一种，其中冰乙酸水溶液优选为1％～10％的冰乙酸水溶液。

所述缓冲溶液的加入量为待测牛奶加入重量的0.1～0.5倍；