[发明专利]一种日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒及其引物和探针

说明书

技术领域

本发明属于病毒核酸检测技术领域，涉及一种基于核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)技术的日本乙型脑炎病毒快速检测技术。具体涉及日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增快速检测试剂盒，以及所述试剂盒中使用的对于乙型脑炎NS1基因具有特异性的引物对和分子信标探针。

背景技术

日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)属于黄病毒科黄病毒属，是一种危害严重的人畜共患病病原。该病毒为单股正链RNA病毒，其核酸序列编码了3个结构蛋白和7个非结构蛋白(Nonstructural protein)，其中各基因型间NS1蛋白的同源性较高，是建立该病核酸检测的良好候选基因。日本乙型脑炎经蚊传播，多见于夏秋季，对患者神经系统的造成不可逆的损伤，病死率高，部分幸存者会遗留中枢神经系统后遗症。我国为日本乙型脑炎高发区，平均年发病数约占全世界乙脑发病数的80％，且主要危害人群为儿童，对人民的健康造成极大的危害。因此建立一套简便快速、特异性强的日本乙型脑炎病毒检测技术，对该病的防控和临床诊有着十分重要的意义。

由于乙脑的流行具有明显的季节性、地区性和临床病变，可以据其进行初步诊断，但确诊还是需要通过实验室诊断，主要包括病毒的分离鉴定、酶联免疫法和RT-PCR等。病毒分离培养法操作繁琐，耗时很长，不适于快速检测和临床紧急病情处理；酶联免疫检测技术受其本身的限制，灵敏度比较低，不利于病程初期的诊断；RT-PCR、荧光RT-PCR以及RT-LAMP等也是基于核酸扩增的检测方法，灵敏度较前两种方法提高了很多，但PCR的扩增需要有反转录步骤以及变性、退火及延伸等多个温度点进行几十次升降温循环，耗时较长，而LAMP方法对引物设计区域要求过高，在变异较大且频繁的RNA病毒上难以实现良好应用。

核酸序列依赖性扩增(NASBA)与以往核酸扩增技术不同，更为高效简便，尤其适用于RNA病毒的检测。NASBA在AMV逆转录酶、T7RNA聚合酶、RNA酶H的介导下，在41℃-42℃恒温条件下，经一对引物在体外连续扩增出均一的特异性的核酸序列。在该技术的基础上结合分子信标探针(moleular beacon)可以建立实时荧光NASBA(Real-time NASBA)扩增技术。Real-time NASBA具有以下特点：①在同一温度条件下进行的等温扩增；②与RT-PCR相比，无需15-30分钟的反转录过程，不受引物量限制，在60-90分钟内使模板RNA扩增10⁹倍以上，灵敏度甚至可以达到检测拷贝数为个位的模板RNA；③只对RNA模板进行扩增，不受双链DNA污染的影响，且产物通过分子信标探针来检测，实现了实时检测并减少了对环境的污染。④与RT-LAMP相比，更容易筛选出检测靶位点，满足变异度高的核酸病毒检测要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于实时荧光核酸序列依赖性扩增技术(Real-time NASBA)对日本乙型脑炎NS1基因具有特异性检测作用的引物对和分子信标探针；此外，本发明还提供了一种包含上述引物对和分子信标的日本乙型脑炎Real-time NASBA检测试剂盒。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终获得了如下技术方案：

一种用于实时荧光等温扩增法检测日本乙型脑炎病毒的特异性引物对，该引物对包括正向引物Primer-1和反向引物Primer-2，所述正向引物和反向引物的碱基序列如下所示：

Primer-1：5’-GACGTTAGCAGGTAGACGAGGCATGATGAAACAACACTC-3’(SEQ ID NO：1)；

Primer-2：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCTCTTGCGAAGGAC-3’(SEQ ID NO：2)。

一种用于实时荧光等温扩增法检测日本乙型脑炎病毒的分子信标探针Tag1，该分子信标探针在其寡核苷酸DNA分子的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记促灭基团DABCYL，探针上的寡核苷酸DNA分子的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。整个探针形式如下所示：

5’FAM-CATCGCAGCTGGGCCTTCTGGTGATGTTTCTCGATG-DABCYL-3’。