[发明专利]一种嗜氯节杆菌海藻糖合成酶及其编码基因和应用

说明书

技术领域

    本发明一种嗜氯节杆菌 (Arthrobacter Chlorophenolicus SK33.001) 的海藻糖合成酶及其编码基因和应用，属于基因工程和现代酶工程技术领域。

背景技术

    海藻糖是一种安全、稳定的非还原性二糖，在自然界中广泛存在，如百余种植物、藻类、真菌、酵母、细菌和无脊椎动物如虾、昆虫、线虫等中都含有一定量的海藻糖。特别是在酵母、霉菌等真菌中，含量可高达生物体干重的20%以上。海藻糖由两个吡喃环葡萄糖以α-1,1-糖苷键连结而成。海藻糖存在3种光学异构体，但α,α型是最为常见的海藻糖，其他两种α,β和β,β型在自然界中很少存在。α,α型海藻糖结构式如式(I)所示。

式（I）

    海藻糖的化学性质稳定，α,α-1,1-糖苷键远低于其他糖苷键能量，高玻璃化温度，无美拉德反应，甜度仅为蔗糖的45%。海藻糖在生物体内表现出许多独特的功能，它可作为结构组分，又可为生物体提供能量，它还是许多生物的应急代谢物，具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒化合物等不良环境条件下活性免遭破坏的功能。外源性的海藻糖对生物体和生物膜、蛋白质等大分子同样具有突出的保护作用，使得海藻糖可作为生物和医学领域的活性大分子的优良保护剂，代替过去常用的血浆白蛋白作为疫苗、蛋白质药物、活菌制剂、血液制品、淋巴细胞、活体组织等生物活性物质的稳定剂。海藻糖独特的功能特性还能在食品加工领域大显身手，如对酸和热的高度稳定性、防止淀粉老化和蛋白质变形、抑制脂肪酸败、矫味矫臭功能、低吸湿度、低甜度、非致龋性等。近年来还在动物实验中发现了海藻糖具有防治骨质疏松症、亨廷顿舞蹈症等作用，扩大了海藻糖的应用范围。

    海藻糖的生产，由最初的天然微生物中提取，到酶法生产，价格从1000美元/kg降到现在10美元/kg以下。海藻糖价格的降低大大扩大了海藻糖的应用范围，可使其广泛应用于医药食品等行业，也加快了海藻糖的应用开发研究。目前海藻糖的酶法生产主要可分为五种途径。第一条途径是磷酸海藻糖合成酶/磷酸海藻糖磷酸酶途径（TPS/TPP Pathway），尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和 6-磷酸葡萄糖（G6P）在 6-磷酸海藻糖合成酶（EC 2.4.1.15，Trehalose 6-Phosphate synthase，TPS）催化下合成 6-磷酸海藻糖（T6P），而后者在 6-磷酸海藻糖磷酸酶（EC3.1.3.12，Trehalose 6-Phosphate Phosphatase，TPP）作用下生成海藻糖。第二条途径是麦芽寡糖基海藻糖途径（TreY/TreZ Pathway），该途径是由麦芽寡糖基海藻糖合成酶（EC5.4.99.15, Maltooligosyltrehalose synthase，MTSase，treY 基因编码）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（EC3.2.1.141, Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase，MTHase，treZ 基因编码）催化完成。反应的主要过程是麦芽糊精还原端两个葡萄糖间的α,α-1,4 糖苷键在MTSase 的催化下转变成α,α-1,1糖苷键，成为麦芽寡糖基海藻糖(Maltooligosyltrehalose)，然后在MTHase的催化下水解释放出一分子海藻糖，而原来的麦芽糊精则转变为减少了两个葡萄糖基的麦芽寡糖，并可作为新一轮反应的底物。第三条途径是海藻糖合成酶途径（TS Pathway）。该途径是由海藻糖合成酶（EC5.4.99.16, Trehalose synthase,TS 基因编码）催化完成的，反应通过分子内转糖苷作用，将α,α-1,4 键连接的麦芽糖转化为α,α-1,1 键连接的海藻糖，反应是可逆的，但倾向于生成海藻糖的方向进行。第四条途径是海藻糖磷酸化酶途径（TreP Pathway）。该途径由一种新的海藻糖合成酶(Trehalose synthase，TSase)催化 D-葡萄糖与 1-磷酸葡萄糖合成海藻糖。这种酶实际上是一种海藻糖磷酸化酶（EC2.4.1.64，trehalose phosphorylase，TreP），因为它也可以催化上述反应的逆反应，即通过磷酸化作用分解海藻糖。第五条途径是海藻糖转糖苷合成酶（TreT Pathway）。海藻糖转糖苷合成酶（Trehalose glycosyl- transferring synthase，TreT），它可以催化 ADP-葡萄糖和葡萄糖分子之间的转糖苷反应，从而生成 ADP 和海藻糖。该反应是可逆反应，但平衡倾向于海藻糖生成方向。