[发明专利]一种具有天然水平糖胺聚糖的脱细胞基质及其制备与应用

说明书

技术领域

本发明属于组织工程领域，特别涉及一种具有天然水平糖胺聚糖的脱细胞基质及其制备方法与应用。

背景技术

在组织工程领域，载体支架材料的制备是进行组织工程构建的关键环节。其中脱细胞基质载体具有天然超微三维结构、丰富的细胞外基质成分及低免疫源性等特点被广泛应用。良好的脱细胞基质载体应具有以下特征：①免疫活性物质被有效去除，生物相容性良好；②天然的结构和成分得到了有效的保护，细胞外基质成分保留程度高。就目前国内外脱细胞基质制备情况看：所得脱细胞基质大体结构保留完整；胶原纤维，层粘连蛋白基本完整保留；弹力蛋白保留率小于40％；糖胺聚糖丢失率大于50％。根据以上实验结果，我们可以发现：目前制备的脱细胞基质虽然能获得较好生物相容性，但其原有胶原网络与部分蛋白质(纤维连接蛋白、层粘连蛋白和弹性蛋白等)被破坏，糖胺聚糖等天然成分大量流失，导致其生物活性、热稳定性、力学强度和耐降解性能等生物学功能常不足以满足临床需要。因此，对脱细胞基质进行改性处理成为了一大关键问题。

现行的脱细胞基质改性方法着眼于脱细胞基质生物学功能的改良。主要分为两大类：表面刻蚀法和交联改性法。表面刻蚀法是指利用物理或化学方法(如光、酸、碱)改变基质表面的粗糙度，增加脱细胞基质的细胞粘附性。其缺点在于：损坏了脱细胞基质的表面天然结构，基质表面的信号结合位点丢失，影响了细胞生长的微环境。交联改性法是目前最常用的脱细胞基质改性方法，具体还可分为：氧化法、交联剂法、物理法和酶法。其中氧化法是指利用光或高能辐照使脱细胞基质中的氨基酸活化并重新结合，改善了脱细胞基质的热稳定性和生物相容性，并增强了机械强度。此外，这种方法不需使用添加剂、可控性高且毒性较小。但此法缺点在于：适用范围小并且照射过程可能会导致基质中的蛋白活性物质变性失活。交联剂法是指使用不同类型的交联剂与脱细胞基质交联，增强脱细胞基质的力学强度并改善其体内降解性能。其缺点在于：交联剂的残留对细胞生长造成影响，还会使脱细胞基质产生一定溶血性。物理法是指利用分子缠绕、盐键、氢键及疏水作用使物理型交联剂在脱细胞基质上形成交联网络，改善了脱细胞基质的力学强度及抗降解性能。这种方法安全隐患小，但物理型交联剂的选择难度较大，并且对于物理交联型水凝胶，分子间的缠绕、疏水相互作用或离子键合区域也会形成簇团结构，因此造成凝胶的不均匀性，同时自由链端和链环也会产生瞬时的网络缺陷。酶法是利用相关酶(转谷氨酰胺酶、辣根过氧化物酶、酪氨酸酶、赖氨酰氧化酶等)催化脱细胞基质发生交联反应，改善其生物相容性。这种方法优点在于：高效、高选择性、交联速率可控、反应条件温和等，但其高选择性也限制了在交联改性中的应用范围。

上述方法的共同特征在于：通过物理、化学和酶的方法改变脱细胞基质中生物活性物质的结构，使其生物活性、热稳定性、力学强度和耐降解性能得到提升。但均存在着一个共同的问题：脱细胞过程中丢失的生物活性成分未得到补充。其中，天然细胞外基质主要成分之一：糖胺聚糖在脱细胞过程中大量流失，然而，糖胺聚糖对维持脱细胞基质结构的稳定性、对细胞的粘附和迁移具有重要意义。它具有良好的保水作用，能够保护细胞外基质中的胶原纤维不受损害，维持细胞外基质的功能活性，特别地，在角膜中，糖胺聚糖(主要为硫酸角质素)的存在可以稳固胶原紧密规则排列，这与维持其透光性密切相关。而在软骨细胞外基质中，糖胺聚糖(主要为硫酸软骨素)的亲水性可以使软骨增厚，并增加关节内的滑液量。并且糖胺聚糖对各种营养物质(如：生长因子等)、细胞因子等有固定和吸附的作用，可以根据周围细胞的需要对其进行调控。然而，糖胺聚糖的大量流失使脱细胞基质的超微结构发生变化，特别地，糖胺聚糖的存留量直接关系到脱细胞角膜体内移植后的透明时间。加之，脱细胞基质中细胞因子及各种生长因子所剩无几，种子细胞与细胞外基质无法建立有效的营养供求平衡，使细胞在体内恶劣的微环境下的活性无法维持。因此，对脱细胞基质中糖胺聚糖含量的检测是十分关键且必要的。就目前脱细胞产品的制备结果看，脱细胞产品糖胺聚糖剩余量不足50％。因此，我们不难发现，本领域相关产品均存在着一个不易克服的共同缺陷：改性后的脱细胞基质无法恢复脱细胞过程中大量流失的生物学活性成分：糖胺聚糖，直接影响了脱细胞产品的超微结构和细胞外基质成分，致使产品的生物学功能改变。

综上所述，满足临床应用要求的脱细胞基质不但需要足够的生物力学强度和良好的生物相容性，还需要要求其在结构和成分上与天然细胞外基质相似。如何通过改性脱细胞基质使其恢复天然细胞外基质生物活性成分是目前制约该类产品发展的关键问题。

发明内容