[发明专利]一种干细胞外泌体补片及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于组织工程领域，特别涉及一种干细胞外泌体(stem cell-derived exosome)补片及其制备方法与应用。

背景技术

干细胞作为生物体内具有增殖、分化潜能，具备自我更新复制能力，能够高度分化的功能细胞，一直是再生医学细胞治疗领域中热门的研究材料。随着细胞治疗研究的深入，由各种方法制备的干细胞补片对治疗心肌梗塞、皮肤创伤、股骨头坏死、糖尿病等组织或器官损伤、功能障碍等疾病显示了一定程度上的治疗作用，许多动物或临床实验研究也证明了干细胞能够发挥促进坏死组织再生修复、改善相关组织器官功能等作用。

传统细胞治疗常以直接注射的方式把干细胞移植到组织损伤部位，后来，许多组织工程研究者利用不同的构建方法把干细胞构建成细胞片再进行体内移植。相较于传统的直接注射细胞悬液的干细胞疗法，干细胞片移植的优势在于：①干细胞经过体外构建形成二维或三维的组织结构，在细胞片移植体内后仍能保持细胞与细胞间及细胞与胞质间的连接，有利于干细胞生物学活性的维持；②能使干细胞定向植入目的区域，不易流失，且在构建过程中人为控制细胞来源、种植密度、构建方法，大大促进细胞治疗的进程；③细胞片移植治疗可明显促进周围组织、细胞新生，对组织器官的损伤修复作用更为明显。

虽然通过干细胞补片移植的方法进行治疗能够一定程度提高损伤组织器官的修复作用，但是在体内进行干细胞移植的治疗方法仍存在一定的缺陷：①数量来源紧缺：从临床应用的角度出发，除造血干细胞和间充质干细胞外，很多种类临床应用价值高的干细胞由于提取困难或伦理问题限制了其临床应用，而异体来源的干细胞移植后易产生免疫排斥反应，如皮肤干细胞、角膜缘干细胞、心脏干细胞、胚胎干细胞等；②干细胞体外的生物学活性难以维持：在目前各种细胞片构建技术中，其研究重点在于如何构建较完整的细胞片，并没有涉及干细胞活性的维持方案，包括目前运用最为成熟广泛的细胞片构建温敏培养法。因此，在使用这些方法进行干细胞补片构建容易导致干细胞在构建过程中出现分化现象，降低其增殖、旁分泌等生物学活性，不利于干细胞在体内发挥组织修复的作用；③干细胞补片构建周期较长：目前干细胞补片构建策略主要通过干细胞高密度种植培养，待细胞之间建立细胞连接连成片状再进行收获和后续加工操作。此类细胞补片构建周期较长，一般需要7至14天，此过程易降低干细胞生物学活性，也不利用干细胞补片产业化生产与保存；④干细胞体内移植存在风险与未知因素：干细胞是一类具有强自我更新能力的细胞，其体内移植成瘤风险是目前干细胞治疗的关注重点之一。另外，由于干细胞治疗发生机制尚不完全清楚，干细胞体内移植后可能因周围环境作用出现过度增殖、未像预期方向分化、迁移、凋亡、免疫排斥等不可控情况，很大程度上影响治疗效果。

随着干细胞作用机制研究的深入，多项研究表明干细胞在体内多数是通过旁分泌生长因子和细胞因子等物质发挥治疗作用，而外泌体正是这类物质的重要转运载体。近年来，研究发现由干细胞天然分泌的外泌体在信息传递、调控、转运、免疫中发挥着重要作用，可广泛应用于临床治疗、美容等方面。外泌体是干细胞分泌的膜性小囊泡，当来源细胞外排时获得其膜蛋白成分，可选择性地将来源细胞内部含有的蛋白质、核酸等运送到受体细胞，调节细胞间信号传导。

相较于构建干细胞细胞补片的组织工程产品来说，干细胞外泌体补片的无细胞产品具有明显优势，具体在于：①来源广泛，易于收集与储存：绝大多数干细胞在一定环境条件下都能够持续不断分泌外泌体，且同种异体间外泌体差异微小，因而可以在细胞培养过程中不断提取外泌体，并通过离心、过滤、色谱、层析、物理吸附等常用方法获得所需外泌体，收集得到的外泌体可于4℃短期保存或-80℃长时间保存；②避免干细胞直接移植：干细胞外泌体补片结构稳定，能极大程度上避免发生类似干细胞补片体内移植后细胞迁移、失效、不定向分化的可能性，提高作用效率；③内容物丰富，治疗效果与干细胞直接移植相似：外泌体是由细胞分泌到体外的囊状结构，包含多种来自细胞内的蛋白质如生长因子、促血管生成因子等，以及核酸、脂类物质，是目前已知的干细胞旁分泌作用中重要的组成；④以补片形式植入提高外泌体作用靶向性：在目前的研究中，研究者多采用外泌体混悬液直接注射到组织或器官中的方法，虽然也有一定的治疗效果，但易造成外泌体的流失，而外泌体补片植入体内后定向作用于目的区域，在该区域能够长时间释放外泌体内的物质，延长外泌体作用时间；⑤易于规范化生产：干细胞外泌体补片更加易于标准化，能够准确测定相关计量和生物学活性，其负载量可人为控制，且补片可大量生产，成本较低、工艺简单。